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水分胁迫下外源脱落酸提高甘蔗抗旱性的机理研究

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摘要

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1 前言

1.1 全球农业生产中的水危机

1.2 水分胁迫与植物生理生化调节机制

1.2.1 活性氧的产生及清除

1.2.2 水分胁迫与光合作用

1.2.3 水分胁迫与渗透调节

1.2.4 水分胁迫与内源激素调节

1.3 外源植物生长调节剂对植物耐胁迫能力的影响

1.4 ABA生物合成及其调节

1.4.1 早期质体中的反应

1.4.2 玉米黄质的环化裂解

1.4.3 胞质中的后期反应

1.5 ABA信号转导

1.5.1 GTG 1/GTG 2介导的ABA信号

1.5.2 PYR/PYL/RCAR介导的ABA信号

1.5.3 ABAR/CHLH的ABA信号转导

1.6 ABA与基因转录调控

1.7 基因芯片在筛选差异表达基因中的应用

1.8 甘蔗抗旱研究进展

1.9 本研究的立论依据及意义

2 水分胁迫下外源ABA对甘蔗生理生化作用的影响

2.1 材料和方法

2.1.1 试验品种与处理

2.1.2 测定项目和方法

2.1.3 数据计算及处理

2.2 结果与分析

2.2.1 ABA含量及叶片相对含水量变化

2.2.2 丙二醛含量变化

2.2.3 可溶性蛋白和脯氨酸含量变化

2.2.4 IAA和GA含量变化

2.2.5 总叶绿素含量和最大量子效率(Fv/Fm)变化

2.2.6 光系统Ⅱ最大光化学效率(Fv’/Fm’)变化过程

2.2.7 光系统Ⅱ实际量子效率(PS2)变化过程

2.2.8 H2O2含量的变化

2.2.9 相关抗氧化酶活性的变化

2.3 小结

3 甘蔗SoNCED基因克隆及表达分析

3.1 材料和方法

3.1.1 试验品种与处理

3.1.2 试验试剂

3.1.3 ABA含量测定

3.1.4 O2-产生速率测定

3.1.5 甘蔗总RNA提取及检测

3.1.6 cDNA第一链合成

3.1.7 SoNCED片段的获得

3.1.8 SoNCED全长的扩增

3.1.9 序列生物信息学分析

3.1.10 实时荧光定量PCR

3.2 结果与分析

3.2.1 甘蔗总RNA质量检测

3.2.2 SoNCED基因片段克隆

3.2.3 SoNCED基因全长克隆

3.2.4 序列生物信息学分析

3.2.5 O2-产生速率变化

3.2.6 不同处理对SoNCED基因表达及ABA含量的影响

3.3 小结

4 水分胁迫及外施ABA条件下甘蔗基因差异表达谱分析

4.1 材料和方法

4.1.1 试验品种与处理

4.1.2 基因芯片规格

4.1.3 主要仪器和试剂

4.1.4 甘蔗总RNA提取

4.1.5 总RNA的纯化

4.1.6 cDNA第一和第二链一步法合成

4.1.7 aaUTP标记的cRNA合成

4.1.8 cRNA纯化

4.1.9 cRNA浓度测定

4.1.10 cRNA样品荧光标记

4.1.11 荧光标记cRNA样品纯化

4.1.12 荧光分子浓度和掺入率计算

4.1.13 cRNA样品片段化及芯片杂交

4.1.14 芯片洗涤

4.1.15 芯片扫描

4.1.16 数据均一化和基因筛选

4.1.17 芯片的qRT-PCR验证

4.2 结果与分析

4.2.1 差异表达基因数量分析

4.2.2 ABA诱导基因筛选

4.2.3 基因功能注释结果

4.2.4 基因功能分类结果

4.2.5 qRT-PCR验证结果

4.3 小结

5 甘蔗ABA信号转导SnRK2基因克隆及表达分析

5.1 材料与方法

5.1.1 试验品种与处理

5.1.2 试验试剂

5.1.3 ABA含量测定

5.1.4 甘蔗总RNA提取

5.1.5 cDNA第一链的合成

5.1.6 基因全长克隆

5.1.7 序列生物信息学分析

5.1.8 实时荧光定量PCR

5.2 结果与分析

5.2.1 SoSnRK2.1序列分析

5.2.2 序列生物信息学分析

5.2.3 蛋白同源比对及聚类

5.2.4 ABA含量变化分析

5.2.5 SoSnRK2.1表达分析

5.3 小结

6 讨论与结论

6.1 全文讨论

6.2 全文结论

6.3 论文创新点

6.4 问题与展望

致谢

参考文献

附录 作者在攻读博士学位期间参与科研项目、学术活动、论文发表情况

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摘要

甘蔗是中国第一大糖料作物,甘蔗糖占我国食糖总产量90%以上,而我国甘蔗种植面积80%以上为丘陵旱地,蔗区农业水利条件较差,降水不均衡,土壤保水能力差,每年都面临不同程度干旱威胁。选育抗旱性强、水分利用率高的甘蔗品种是我国甘蔗糖业可持续发展的重要保证,但由于甘蔗遗传背景复杂,通过常规杂交育种方法进行甘蔗遗传改良所需周期比较长,亟需其它辅助手段解决甘蔗抗旱性问题。本研究选用甘蔗品种桂糖21号(GT21),比较在进行水分胁迫和胁迫加喷施外源脱落酸(ABA)处理条件下,甘蔗叶片内相关生理生化变化及其与抗旱性的关系,运用基因芯片比较两处理条件下差异表达基因异同并筛选ABA诱导基因,对ABA合成及信号转导过程关键基因进行克隆及表达分析,主要研究内容和结果如下:
   1.以GT21为材料,研究水分胁迫及胁迫加叶面喷施ABA对甘蔗内源ABA含量及相关生理生化指标的影响,结果表明,干旱及干旱加外施ABA条件下,甘蔗内源ABA含量水平上升,但干旱加ABA处理增幅更显著,甘蔗叶片相对含水量随着胁迫加剧而逐渐下降,外施ABA能提高甘蔗保水能力。水分胁迫下,甘蔗叶内脯氨酸、可溶性蛋白、H2O2、丙二醛(MDA)含量增加,ABA处理能使渗透调节物质含量处于更高水平,并降低MDA含量,缓解其积累给细胞带来的伤害。水分胁迫及ABA处理均能提高GT21叶片中IAA含量而降低GA含量。ABA处理能防止叶绿素降解并对干旱引起的最大光能转化效率(Fv/Fm)、最大光化学效率(Fv'/Fm')、光系统Ⅱ实际量子效率(PS2)下降有明显缓解作用。在干旱条件下,H2O2积累伴随着抗氧化系统相关酶CAT、GPX、GR和APX活性提高,ABA处理能进一步提高上述酶活性而使活性氧清除能力得到增强,表明在干旱条件下,外施ABA处理能增强甘蔗抗氧化防护系统,从而提高其抗旱性。
   2.以已发表的NCED蛋白序列保守区域为模板,设计简并引物,运用RT-PCR方法,从GT21中克隆得到NCED基因序列表达标签后,采用RACE-PCR技术,扩增出该基因全长cDNA序列并命名为SoNCED。序列分析表明SoNCED全长2521 bp,包含长度为1827 bp的开放阅读框,编码608个氨基酸,推导氨基酸序列分子量65.9kDa,等电点6.04,聚类分析表明其与玉米和高梁等同属C4植物的NCED进化关系较近。生物信息学分析表明,SoNCED的N末端有典型叶绿体转运肽结构,组成其基本二级结构的α-helices、β-strands、β-propeller、与铁离子结合起催化作用的组氨酸位点,α-helices结构中富含疏水氨基酸残基等,性质高度保守。实时荧光定量PCR分析结果表明,25%PEG-6000模拟干旱胁迫处理、对照加ABA及干旱加ABA处理下,GT21叶片及根系SoNCED都随着O2-产生速率升高表达量显著上升,并与ABA含量增长具有协同效应,表明SoNCED参与甘蔗叶片及根系内源ABA合成调控。
   3.应用安捷伦4×44 K基因芯片研究水分胁迫及胁迫加叶面喷施ABA对甘蔗基因表达的影响,结果表明,ABA处理在第3、第5天差异表达基因数量均高于单施干旱处理;胁迫前期,两处理差异基因以上调表达为主,后期下调表达占多数。从ABA处理第3天的样品中筛选到231个ABA响应基因,与第5天各处理差异基因相比,其中71个基因只在ABA处理第3天表达,72个在所有处理中共表达,38个只在ABA处理第3、第5天共表达,50个只在干旱处理第5天表达。使用BlastX对上述231个基因进行功能注释,共获得有效注释信息基因173个,基因功能分类结果表明,功能未知的假定蛋白所占比例最高,约占总数10%;参与脂类代谢、信号转导,编码蛋白激酶和渗透调节物质基因所占比例次之,都约占9%;参与蛋白质代谢、ABA代谢基因约占总数的6%;与光合作用、碳水化合物代谢、转运蛋白相关的基因分别约占5%;其它差异表达基因参与的功能还有呼吸作用、转录因子、激素代谢、氧化胁迫、氮代谢、细胞代谢等。实时荧光定量PCR实验表明芯片实验结果是可靠和可重复的。
   4.以芯片实验基因筛选结果为参考,应用RCAE技术扩增出与水稻中非酵解型蛋白激酶基因SAPK3同源性极高的甘蔗基因全长cDNA并命名为SoSnRK2.1。序列分析表明,该基因全长cDNA为1385 bp,开放阅读框长为1002 bp,编码333个氨基酸,并与其它物种SnRK2基因具有很高同源性,聚类分析显示该基因属于SnRK2家族第一亚家族。预测SoSnRK2.1分子量为37.8 kDa,等电点为5.54,是亲水性非跨膜蛋白质,在第5-261位氨基酸之间存在蛋白激酶保守催化域,分别具有11、3和8个潜在丝氨酸、苏氨酸、络氨酸磷酸化位点,二级结构中以环状结构所占比例最大。实时荧光定量PCR结果显示该基因在甘蔗叶片中受ABA及水分胁迫诱导表达,与ABA含量有着协同增长关系,推测其在叶中起着ABA信号转导作用;根系中不同处理该基因表达整体呈下降趋势,推测与ABA信号转导通路冗余性相关。

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