2,4-二氯苯氧乙酸降解相关基因的克隆及表达研究

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2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）是一种人工合成的苯氧乙酸类除草剂，农业施用后的药物残留对环境和人的健康会造成一定的危害。环境中残留的2,4-D主要通过微生物降解， 2,4-D的微生物降解主要是经2,4-二氯苯酚途径和4-氯苯氧乙酸途径进行。本研究以2,4-D降解菌株Cupriavidus campinensis BJ71为研究的出发菌株，具体研究结果如下：探讨了BJ71菌株在含500mg/L 2,4-D的MSM中的生长状况，发现利用蔗糖、葡萄糖和柠檬酸钠为辅助碳源以及利用酵母浸出粉和蛋白胨为氮源时可促进BJ71的生长；高于2%NaCl对菌株生长有一定抑制；50mg/L Mn2+和Pb2+并不会抑制BJ71的生长，高于50mg/L Cd2+和Cu2+以及0.1mg/L Hg2+对BJ71的生长具有一定抑制，菌株无法耐受高于0.3mg/L Hg2+。BJ71经无2,4-D压力传代培养35代后获得菌株BJ71-F35，消除质粒后获得菌株BJ71-DP1，与原始菌株BJ71相比，BJ71-F35的生长较BJ71弱，而BJ71-DP1几乎未见明显的生长趋势，表明BJ71菌株对2,4-D的降解稳定性略弱，含有起始2,4-D降解的基因位于质粒上。从质粒和部分核基因的序列信息中获得139个异生物质降解相关基因，其中包括2,4-D经4-氯苯氧乙酸途径的降解基因簇catABC，本研究选取邻苯二酚双加氧酶基因catA进行克隆表达研究。PCR扩增catA基因产物与pGEM-T Easy载体连接转化E.coli DH5α获得克隆子，经菌落及质粒PCR验证后送出测序获得基因全长序列。catA基因全长939bp ，编码312个氨基酸。catA基因序列与Cupriavidus metallidurans Ni-2菌株的邻苯二酚1,2-双加氧酶DnaA基因（NCBI登录号：CP026544 ）和C. metallidurans CH34菌株的偏苯三酚1,2-双加氧酶（1,2-HQD）基因（NCBI登录号：CP000352）的一致度分别为77.6%和77.5%， catA基因编码产物CatA蛋白与其编码氨基酸序列的相似度均为91.7%，一致度均为85.6%。对CatA蛋白进行生物信息学分析，该蛋白分子量约为34KDa，属于不太稳定的可溶性亲水蛋白，不含信号肽和卷曲螺旋域，不形成亮氨酸拉链，在细胞内不进行跨膜转运，定位在细胞周质的可能性极大。该蛋白降解邻苯二酚的酶活性位点可能位于146~174的氨基酸序列。二级结构预测显示α螺旋占比22.76%、β转角占比11.22%、延伸链占比25.96%、无规卷曲占比40.06%。利用RaptorX预测三级结构，并获得较好的结构。以克隆菌株的质粒为模板，设计含有酶切位点的引物PCR扩增全长catA，将PCR产物与表达载体pET28a双酶切后连接转化E.coli BL21(DE3)获得表达菌株pET28a-catA-E.coli BL21(DE3)。经不同诱导时间及温度、不同IPTG浓度进行catA基因的诱导表达，提取粗酶液进行SDS-PAGE，结果表明温度和IPTG浓度对蛋白表达量并无太大影响，随着诱导时间的增加，蛋白表达量增加，12h后具有较好的表达量。提取粗酶液经镍柱纯化后获得CatA蛋白纯酶。酶学特性研究表明，CatA蛋白酶促反应的最适温度为35℃，最适pH为8.0，在该条件下CatA蛋白的米氏常数Km为40.02μmoL/L，最大反应速率Vmax为56.5μmoL/(L·min)，转换数kcat为36.45s-1。对其热稳定性的研究表明，低于40℃时，CatA蛋白能保持较好的酶活性，温度为45℃时仅能维持28%的酶活性，超过50℃时，酶完全失活；pH稳定性的研究表明，CatA蛋白在pH7.0~9.0范围内能维持其酶活，当pH值为6.0和10.0时，仅能够维持30.39%和23.32%的活性，pH低于6.0或高于10.0时完全失活。CatA蛋白不能以对苯二酚为底物，而以4-甲基儿茶酚为底物时，与邻苯二酚底物相比，其酶活仍可保持87.9%。

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作者
陈森;
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作者单位

贵州大学;

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授予单位贵州大学;
学科生物学
授予学位硕士
导师姓名韩丽珍;
年度 2018
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类 TQ4;TQ3;
关键词
二氯苯; 酸降解; 相关基因; 克隆;

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