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外源性VEGF复合BMP对兔同种异体脱钙骨异位构建血管化骨的影响

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由创伤、感染和骨肿瘤引起的大段骨缺损的修复治疗一直是骨科医师面临的难题之一。目前在临床中，自体骨移植一直被认为是治疗骨缺损的金标准之一，但是当自体骨移植修复骨缺损后会常常或面临一些感染、疼痛、神经损伤等并发症，同时由于自体骨移植取材有限，从而限制了其在临床上的应用。随着对骨移植替代材料的不断深入研究，同种异体骨凭借其来源广、可满足多种形态的骨缺损修复，有骨诱导、骨传导等优点，在临床上得到广泛应用，然而同种异体骨在修复骨缺损的过程中会面临着再血管化和骨重建等难题，针对这些难题，许多学者都进行了不断探索研究，在前期试验中也通过把同种异体骨异位于兔右侧大腿血供丰富的股直肌与股内侧肌间隙内近隐动脉处，经过一段时间同种异体骨可再血管化为活化骨。为了能加速同种异体骨异位再血管化为活化骨的进程，缩短二期移植骨爬行替代修复骨缺损的时间，在本实验中，选择中国白兔作为实验对象，以兔同种异体脱钙骨作为移植骨材料，设想通过施加外源性血管内皮细胞生长因子（VEGF）和骨活性发生蛋白（BMP）加快同种异体骨异位血管化为活化骨的速度，缩短其二期骨缺损修复的爬行替代的进程。 目的： 探讨外源性VEGF复合BMP对兔同种异体脱钙骨异位构建血管化骨进程的影响。 方法： 选用成年中国白兔210只，雌雄不限，随机取30只作为供体制备同种异体脱钙骨，其余按随机数字表分为实验组：实验组A(同种异体脱钙骨+VEGF+BMP)60只、B(同种异体脱钙骨+VEGF)60只,对照组(同种异体脱钙骨)60只。实验组A将制备好的1.5cm长同种异体脱钙胫骨段置于兔右大腿股直肌与股内侧肌间隙近隐动脉处，并用2根0.8mm克氏针将其固定于股骨上，于其附近皮下植入一枚胶囊渗透压泵，泵内载有浓度为0.5μg/ml的VEGF溶液200μl，同时将浓度为1μg/ml的BMP溶液取1ml滴在凝胶海绵上并植入移植骨内；实验组B做与实验组A相同处理，但不施加BMP；对照组取等长同种异体脱钙骨同法置于兔右大腿相应部位。每组分别于术后0、2、4、6、8、10、12周处死10只白兔，通过大体标本观察、HE染色观察、CD34计数、I型胶蛋白荧光强度检测、Ca2+含量检测和骨碱性磷酸酶检测，分析判断外源性生长因子对同种异体脱钙骨异位再血管化和成骨活性的影响。 结果： 一、大体标本观察结果 术后2周三组实验白兔术后切口愈合均良好，未见明显炎性溶液渗出。术后4周，观察到实验组A骨段表面有少量结缔组织覆盖，且与周围软组粘连较为紧密，与2周时相比骨段表面出现一些较为表浅的骨吸收陷窝；实验组B观察到异位骨段与周围软组织有一定的粘连，骨段表面也出现少许浅表性陷窝；对照组骨段与周围组织粘连较为疏松，骨段表面也仍然较为光滑、无明显陷窝。随着预构时间的进一步延长，骨段与周围组织粘附紧密，有大量纤维结缔组织长入髓腔，形成较疏松的纤维结缔组织支架，取出骨段发现骨表面色泽较暗，陷窝进一步加深。 二、HE染色结果 0周时，三组骨段骨组织哈佛管内残留极少量的结缔组织，未见明显的血管残留结构。2周时，实验组A可见较少量新生血管和破骨细胞分布在哈弗管内，实验组B哈弗管周围无明显的血管长入，仅有少许肉芽组织，对照组观察大哈弗氏管周围无明显变化。4周时，实验组A哈佛管内出现较多新生微血管分布在管腔旁；实验组B哈弗管管腔增大，管内新生微血管增多且伴随着部分致密结缔组织；对照组的哈弗氏管内逐渐出现少许的微血管样结构，余未见明显变化。当预构进程进一步延长可发现哈弗管基本稳定，管内分布较多粗、细不等的成熟骨小梁，且伴随着大量的骨细胞分布其周围。 三、免疫荧光检测结果 CD34免疫荧光染色结果显示：CD34的阳性血管数量随着时间的延长，三组的实验结果都呈现先增加，然后减少的趋势，且实验组A和实验组B在前8周的增加趋势明显高于对照组，但实验组A和实验组B无明显差别。实验组A的CD34阳性血管数和实验组B的CD34阳性血管数均在术后第6周达到最大值，对照组的阳性血管数在第8周达到最大值，实验组A第6周的血管生成量明显多于对照组第8周的血管生成量，同时实验组A的血管生成量稍多于对照组第B周的血管生成量，实验组B第6周的血管生成量也多于对照组第8周的血管生成量，且做组间比较（P＜0.05）。实验组A组内作比较，前六周随着观察时间的增加，CD34阳性血管数也呈现增加趋势，且4周的CD34阳性血管数少于6周时CD34阳性血管数，（P＜0.05），8周时的CD34阳性血管数也少于6周时CD34阳性血管数（P＜0.05）；实验组B组内比较结果与实验组A相似；对照组组内对比发现，6周时的CD34阳性血管数同样少于8周时的CD34阳性血管数，10周CD34阳性血管数少于8周时CD34阳性血管数（P＜0.05）。 Ⅰ型胶原蛋白的荧光强度值，三组I型胶原蛋白的荧光强度值总体变化趋势：实验组A在术后到第6周内Ⅰ型胶原蛋白吸光度值一直处于上升状态，从第6周到第12周内吸光度值呈下缓慢降趋势；前6周内每次观察点值与上一观察点比较差异均有统计学意(P＜0.05)，第6周与第10周、12周比较无统计学意义（P＞0.05）。实验组B从0周到第8周一直处于上升趋势，从第8周到第12周I型胶原蛋白荧光强度值出现下降趋势。且在前8周内，每次观察点的吸光度值与上一观察点比较差异有统计学意义（P＜0.05），第8周与第10周比较无统计学意义（P＞0.05）；对照组从0周到第10周一直处于上升趋势，从第10周到第12周I型胶原蛋白荧光强度值出现下降趋势。且在前10周内，每次观察点的吸光度值与上一观察点比较差异有统计学意义（P＜0.05），第10周与第12周比较无统计学意义（P＞0.05）；A第6周时I型胶原蛋白的荧光强度大于实验组B第10周数值，实验组B第8周时I型胶原蛋白的荧光强度大于对照组第10周数值，但组间对比差异均无统计学意义(P＞0.05)。 四、钙含量检测 随着同种异体脱钙骨在肌间隙内构建血管化骨的进程延长，发现，三组的钙含量都在呈现不同程度的下降。对于实验组A结果示，在4周到6周的观察节点，钙含量由较为明显的下降趋势，且差异有统计学意义（P＜0.05）。从6周到8周结果示钙含量有稍微的增加，但统计学无意义。从第8周到12周，钙含量仍出现下降的趋势。实验组B术钙含量在第6周到8周有下降趋势，且有统计学意义（P＜0.05）；但是在第8周到10周，钙含量又出现增加趋势，但总体趋势是下降的，且无统计学意义；第10周到12周，钙含量又呈现下降的趋势。对照组的钙含量同样随着时间的延长，呈现逐渐下降趋势，虽然在个别观察点有增加趋势，但差异无统计学意义(P＞0.05)。 五、骨碱性磷酸酶检测 随着构建血管化骨及骨活化的时间增加，实验组ABALP的含量则在第6周达到最大值，且在第6周到第10周出现缓慢下降趋势。实验组B在第8周前其BALP含量也在逐渐的增加，在第8周达到峰值，然后在第10周至第12周出现略微下降趋势。对照组则在第10周前，骨组中BALP的含量呈现逐渐增加的趋势，在第10周出现最大值。 结论： 兔同种异体脱钙骨在异位构建血管化骨的过程中，施加外源性的生长因子VEGF和BMP可以明显促进同种异体脱钙骨异位构建血管化骨的进程。

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