声明
摘要
1.1研究目的及意义
1.2国内外研究进展
1.2.1酸土脂环酸芽胞杆菌的简介
1.2.2酸土脂环酸芽胞杆菌检测方法的研究进展
1.3存在的主要问题
1.4本研究的主要内容
1.4.1跨越式滚环等温扩增技术(Saltatory rolling circle amplification,SRCA)
1.5技术路线
2材料与方法
2.1.1试验菌株
2.1.2主要仪器与试剂
2.1.3培养基与果汁样品
2.2试验方法
2.2.1菌株的培养
2.2.2基因组DNA的提取
2.2.3 SRCA引物设计
2.2.4 SRCA预反应体系及反应条件
2.2.5 PCR引物设计
2.2.6 PCR反应体系及反应条件
2.3 SRCA反应条件及反应体系的优化
2.3.1优化反应试验阳性对照和阴性对照设置
2.3.2引物缺省试验
2.3.3反应温度优化
2.3.5引物添加量优化
2.3.6 Mg2+添加量优化
2.3.7 dNTPs添加量优化
2.3.8 Bst DNA聚合酶缓冲液添加量优化
2.3.9模板添加量优化
2.3.10 Bst DNA聚合酶大片段添加量优化
2.4引物特异性分析
2.5 SRCA扩增结果分析
2.5.1 SRCA扩增产物测序分析
2.5.2 SRCA扩增产物酶切验证
2.6灵敏度分析
2.6.1 SRCA方法的灵敏度试验
2.6.2 SRCA凝胶电泳法灵敏度
2.6.3 SRCA荧光可视法灵敏度
2.6.4 SRCA沉淀可视法灵敏度
2.6.5 PCR方法的灵敏度
2.7人工污染苹果汁中酸土脂环酸芽胞杆菌的检出限
2.7.1人工污染样品处理
2.7.2 SRCA凝胶电泳法检出限
2.7.3 SRCA荧光可视法检出限
2.7.4 SRCA沉淀可视法检出限
2.7.5 PCR方法的检出限
2.8 SRCA方法的应用
3结果与分析
3.1 SRCA反应条件及反应体系的优化
3.1.1引物缺省试验
3.1.2反应温度优化
3.1.3反应时间优化
3.1.4引物添加量优化
3.1.5 Mg2+添加量优化
3.1.6 dNTPs添加量优化
3.1.7 Bst DNA聚合酶缓冲液添加量优化
3.1.8模板添加量优化
3.1.9 Bst DNA聚合酶大片段添加量优化
3.2 SRCA最佳反应体系
3.3引物特异性验证
3.3.1 SRCA凝胶电泳法引物特异性验证
3.3.2 SRCA荧光可视法引物特异性验证
3.3.3 SRCA沉淀可视法引物特异性验证
3.4 SRCA扩增结果分析
3.4.1 SRCA扩增产物的测序分析
3.4.2 SRCA扩增产物的酶切分析
3.5 SRCA的灵敏度分析
3.5.1 SRCA凝胶电泳法灵敏度测定
3.5.2 SRCA荧光可视法灵敏度测定
3.5.3 SRCA沉淀可视法灵敏度测定
3.5.4 PCR凝胶电泳法灵敏度测定
3.6人工污染苹果汁中酸土脂环酸芽胞杆菌检出限
3.6.1 SRCA凝胶电泳法检出限
3.6.2 SRCA荧光可视法检出限
3.6.3 SRCA沉淀可视法检出限
3.6.4 PCR凝胶电泳法检出限
3.7 SRCA方法的应用与评价
4讨论
4.1 SRCA检测酸土脂环酸芽胞杆菌方法的评价
4.2特异性基因的选择
4.3引物设计
4.4 SRCA反应的主要影响因素
4.4.1反应温度
4.4.2 DNA模板
4.4.3引物
4.6 SRCA扩增产物的分析
4.7 SRCA反应注意事项
4.8展望
5结论
参考文献
作者简介
致谢
河北农业大学;