重组人INFα2b/igG4 Fe融合蛋白在杆状病毒昆虫系统中的表达

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背景和目的
　　慢性乙型病毒性肝炎是一种严重危害人类健康的常见病，全球目前约有3.5亿慢性乙型肝炎病毒感染者；慢性丙型病毒性肝炎亦影响着全球近1.8亿人，该病的危险性主要在于其高慢性化率和可能发生的严重并发症，包括肝硬化和肝癌。病毒性肝炎的防治是一个全球性公共卫生问题，已引起世界各国的关注。
　　干扰素(interferon，IFN)是目前公认的有效抗病毒药物，迄今在临床上已经使用了20多年。然而，作为一个小分子蛋白，干扰素从血浆中清除的速度较快，其清除相半衰期为注射后的3～8h，24h后在血浆中就已检测不到其存在，导致在临床治疗中需要重复多次给药才能达到治疗效果，造成临床应用中的一些不利[1]。因此延长IFNα的半衰期，降低其副作用对IFNα的临床应用具有重要意义。目前延长干扰素半衰期的方法主要有聚乙二醇(PEG)修饰法、融合蛋白法。近年来，人们关注抗体IgGFc段与干扰素融合蛋白(IFN/Fc)的生物学活性和药理作用。这两种干扰素融合蛋白的研制受到国内外学者的广泛关注，作为一种新的基因工程药物在表达系统建立和蛋白质纯化等方面进行了前沿性研究。
　　本课题基于近几年蛋白质表达系统的研究进展，通过分子克隆技术和蛋白质工程技术，依据IgG Fc及IFN的特点，利用Bac-to-Bac杆状病毒昆虫表达系统，表达长效IFN/Fc融合蛋白，探索其基本生物学活性，期望提高干扰素的抗病毒治疗效果，为长效干扰素的抗病毒治疗探索新方法。
　　方法
　　 1.利用分子克隆技术获得人IFNα2b及IgG4 Fc基因片段，构建杆状病毒穿梭载体pFastBacl-IFN/Fc
　　 2.转化DH10 Bac感受态菌株，获得重组杆粒Bacmid-IFN/Fc
　　 3.运用脂质体转染技术，将重组杆粒Bacmid-IFN/Fc转染至昆虫细胞High five，
　　 4.采用Western-Blot和ELISA检测目的蛋白的表达
　　 5.运用细胞病变抑制法测定融合蛋白体外抗病毒活性
　　结果
　　 1.经PCR扩增、限制性内切酶酶切及核苷酸序列测定，证实获得IFNα2b及IgG4Fc基因片段，且正确克隆至杆状病毒穿梭载体pFastBacl中
　　 2.在DH10 Bac菌株中筛选出含目的基因的重组杆粒
　　 3.重组杆粒转染High Five细胞后出现病理变化，表明转染成功并获得重组杆状病毒
　　 4.ELISA证实兔抗人IFNα抗体能够识别重组IFN/Fc融合蛋白
　　 5.Western-Blot鉴定IFN/Fc融合蛋白显示，在45kD处有特异性的蛋白条带
　　 6.用细胞病变抑制法测定IFN/Fc融合蛋白生物学活性为580IU/ml
　　结论
　　利用杆状病毒昆虫系统成功地表达重组人IFN/Fc融合蛋白，为新型长效干扰素研制及慢性病毒性肝炎治疗提供实验依据。

著录项

作者
姬朝霞;
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作者单位

新乡医学院;

展开▼
授予单位新乡医学院;
学科内科学
授予学位硕士
导师姓名韩双印;
年度 2012
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类 R512.62;
关键词
慢性乙型病毒性肝炎; 干扰素; 杆状病毒昆虫系统; IFN/Fc融合蛋白;

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