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无毛大白猪生物学特征与无毛性状遗传机制研究

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论文说明

摘要

中英文缩写对照表

1 引言

1.1 影响被毛类型的因素

1.2 毛囊形态发生及其信号转导通路

1.2.1 毛囊形态发生

1.2.2 信号通路

1.3 参与毛囊形态发生发育相关基因

1.3.1 β-catenin基因

1.3.2 DKK1基因

1.3.3 BMP4基因

1.3.4 Shh基因

1.4 小结

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 研究对象

2.1.2 菌株、载体和细胞

2.1.3 试剂盒、工具酶及其他试剂来源

2.1.4 试剂配制

2.1.5 主要仪器设备

2.1.6 数据库及分子生物学软件

2.2 研究方法

2.2.1 无毛表型猪生物学特性

2.2.2 无毛性状遗传规律

2.2.3 无毛表型猪皮肤组织学特性

2.2.4 候选基因DKK1与β-catenin基因启动子区变异位点的发现与鉴定

2.2.5 启动子区克隆及活性分析

2.2.6 变异位点碱基缺失质粒的构建

2.2.7 细胞培养及转染

2.2.8 Luc报告基因活性检测

2.2.9 β-catenin基因在不同细胞内表达分析

2.2.10 统计分析

3 结果与分析

3.1 被毛突变大白猪生物学特性

3.1.1 皮肤被毛

3.1.2 生长性能

3.1.3 体尺指标

3.1.4 繁殖性能

3.1.5 屠宰性能

3.1.6 肉质性状

3.2 无毛性状遗传规律

3.2.1 不同交配类型及后代表型

3.2.2 被毛遗传规律

3.3 被毛及皮肤结构观察

3.3.1 被毛及毛囊组织

3.3.2 无毛表型猪皮肤组织学

3.3.3 真皮层厚度

3.3.4 毛囊密度

3.4 候选基因启动子区变异位点检测

3.4.1 基因组DNA提取结果

3.4.2 DKK1基因启动子区序列分析、测定及变异位点筛查与分析

3.4.3 β-catenin基因启动子序列分析、测定及变异位点筛查与分析

3.5 DKK1基因启动子区的克隆及其活性分析

3.5.1 DKK1基因核心启动子分析

3.5.2 变异位点对DKK1基因启动子转录活性的影响

3.6 β-catenin基因启动子区的克隆及其活性分析

3.6.1 β-catenin基因核心启动子分析

3.7 β-catenin基因在不同细胞内表达分析

3.7.1 RNA提取结果

3.7.2 反应曲线

3.7.3 β-catenin基因mRNA表达

4 讨论

4.1 无毛大白猪生产性能

4.2 大白猪无毛性状遗传规律

4.3 无毛大白猪被毛及皮肤

4.4 基因SNP筛选及其群体遗传检测

4.4.1 SNP筛查

4.4.2 SNP的群体遗传检测

4.5 启动子结构与功能

4.6 启动子活性及变异位点

4.6.1 转染细胞的选择

4.6.2 转录活性分析

4.7 有待进一步研究的问题

5 结论

参考文献

在读期间发表论文情况

作者简历

致谢

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摘要

为充分了解新发现“无毛”表型大白猪群体,本研究以无毛表型猪为研究对象,以正常表型大白猪为对照,对“无毛”表型大白猪的生物学特性,包括生长性能、体尺指标、繁殖性能、屠宰性能和肉品质进行了测定,探讨了无毛性状的遗传规律,分析了皮肤组织学特性,同时采取候选基因关联研究策略,运用生物信息学方法,结合生物学软件分析候选基因的序列特征,采用PCR产物直接测序的方法,筛查与大白猪毛囊发育和毛囊密度密切相关的候选基因,为阐明大白猪无毛性状形成的分子机制奠定基础。
  无毛表型大白猪生物学特性研究结果显示,在相同饲养条件下,无毛表型仔猪初生重、达100 kg体重日龄、体尺指标、100 kg活体背膘厚及繁殖性能均与正常表型大白猪无显著差异(P>0.05)。在屠宰性能上,“无毛”表型大白猪宰前活重、胴体重、屠宰率、背膘厚、瘦肉率、脂肪率、骨率、皮率均与正常表型大白猪无显著差异(P>0.05);在肉质性状上,“无毛”表型大白猪肉色、pH值、大理石纹、肌内脂肪含量均与正常表型猪无显著差异(P>0.05)。结果表明,“无毛”大白猪在主要生产性能方面均表现正常,无毛性状对猪的繁殖性能、生长发育和产肉性能均无显著影响。
  通过设置相同表型间交配及不同表型间正反交杂交组合试验,统计各杂交组合后代的表型,根据遗传学定理,分别对无毛性状是由一对基因或两对基因控制的情况进行逻辑推理,进而确定无毛性状的遗传规律。结果显示,大白猪的无毛性状不是由简单的一对或两对基因位点控制的,该结果表明无毛性状可能是由更多基因之间相互作用的结果。
  通过显微观察无毛表型大白猪被毛纤维结构和皮肤组织结构,结果显示:无毛表型大白猪毛干鳞片多呈鱼鳞状;毛干髓质所占比例较正常被毛小,而皮质所占比例相对较大。在不同阶段,无毛表型猪被毛纤维平均细度较被毛正常表型猪小,且均有极显著差异(P<0.01)。不同部位真皮层厚度也较正常被毛表型猪薄,且单位面积毛囊密度较小。
  本研究发现大白猪的DKK1基因启动子区存在4个变异位点-1833C/T、-1808C/G、-1628AATA插入/缺失、-1268TT插入/缺失,共生成7种单体型。独立卡方检验结果显示:3个变异位点-1833C/T、-1808C/G、-1268ins/del的基因型在无毛表型和正常表型中均存在极显著差异(P<0.01),由此可知,DKK1基因启动子区变异位点基因型分布与无毛表型相关联;利用启动子在线预测软件对DKK1基因启动子区变异位点预测发现,-1833C>T和-1268(ins/del)变异均未破坏转录因子结合位点,位点-1808C>G变异,由HNF-1C转录因子结合位点变为C/EBPalp和GR;而位点-1628(ins/del)的变异使得核心区将不包含TATA-box序列结构。此外,还发现大白猪β-catenin基因启动子区存在3个变异位点-1288G>T、-1182TATT插入/缺失、-401TATT插入/缺失,共生成5种单体型,研究发现这些变异位点的基因型分布与无毛表型相关联;利用启动子在线预测软件对β-catenin基因启动子区变异位点预测发现,位点β-catenin-1288可结合转录因子为C/EBPalp,碱基G突变为T后会增加一个YY1转录因子结合位点;位点β-catenin-1182(ins/del)和β-catenin-401(ins/del)变异后使得该位点附近序列能够结合的转录因子随即丢失,此外β-catenin-1182位点缺失TATT四个碱基后,核心区也不存在TATA-box序列结构,因而可推测以上变异位点均可能影响基因的转录活性。
  根据DKK1基因启动子的序列特征,构建5个不同缺失片段的pGL3-DKK1双荧光素酶表达载体,分别转染293T细胞和Hela细胞,并进行双报告基因活性检测。结果显示,DKK1基因启动子对239T细胞具有偏好性,且5个重组pGL3-Basic载体荧光素酶活性均显著高于pGL3-Basic空载体,其中p-1679/+292 bp启动子片段活性最高,且显著高于其他缺失片段(P<0.01);-215-+219 bp维持了基础转录活性,为核心启动子区域;-586-953 bp区域可能存在负调控元件,在-953-1679 bp区域可能存在正调控元件。进而构建变异位点碱基缺失质粒表达载体,转染293T细胞,荧光素酶活性活性检测结果显示:PGL3-4(-16284N del和-12682N del)的启动子活性最弱,其次为PGL3-2(-16284Ndel)、PGL3-3(-12682N del),且均极显著低于PGL3-1(P<0.01),结果表明变异位点碱基的缺失对DKK1基因的转录活性有显著影响(P<0.01)。
  依据β-catenin基因启动子的序列特征,构建3个不同缺失片段的pGL3-β-catenin双荧光素酶表达载体,分别转染293T细胞和Hela细胞,并进行双报告基因活性检测。结果均显示,试验组各组相对荧光素酶活性数值极低。进而采用RT-PCR和荧光定量PCR方法,对β-catenin基因在不同细胞中的表达进行相对定量,结果显示:表达量由高到低依次为293T、LNCap、MCF7、PC3、HepG2细胞。因而可推测该基因在细胞中的表达具有特异性。

著录项

  • 作者

    胡慧艳;

  • 作者单位

    河北农业大学;

  • 授予单位 河北农业大学;
  • 学科 动物遗传育种与繁殖
  • 授予学位 硕士
  • 导师姓名 贾青;
  • 年度 2015
  • 页码
  • 总页数
  • 原文格式 PDF
  • 正文语种 中文
  • 中图分类 S828.2;
  • 关键词

    大白猪; 无毛性状; 生物学特性; 遗传机制;

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