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产柚苷酶细菌菌株的分离、鉴定、转化特性以及转化条件优化研究

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摘要

第一章 引言

1.1 柚皮素的分布

1.2 柚皮素的结构及生物学活性

1.3 柚皮素的获取方式

1.3.1 化学方法

1.3.2 生物方法

1.4 研究意义及创新点

1.4.1 研究意义

1.4.2 创新点

第二章 中药化橘红中主要活性成分柚皮苷的提取分离及结构鉴定

2.1 材料

2.1.1 试验材料

2.1.2 试剂

2.1.3 主要试验仪器与设备

2.2 试验方法

2.2.1 化橘红成分的粗提取

2.2.3 高效液相色谱条件

2.3 结果与分析

2.3.1 化橘红中主要活性成分的提取分离

2.3.2 化橘红中主要活性成分的结构鉴定

2.4 小结

第三章 产柚苷酶细菌菌株的分离筛选与鉴定

3.1 材料

3.1.1 样品来源

3.1.2 筛选培养基

3.1.3 药品与试剂

3.1.4 主要试验仪器与设备

3.2 试验方法

3.2.1 柚皮苷转化菌的分离筛选

3.2.2 菌株革兰氏染色及耐氧性测定

3.2.3 柚皮苷转化菌株的16S rDNA序列分析

3.2.4 生理生化鉴定

3.3 结果与分析

3.3.1 柚皮苷转化菌株的分离筛选

3.3.2 柚皮苷转化菌株的菌体及菌落形态特征

3.3.3 革兰氏染色与耐氧特性

3.3.4 16S rDNA序列分析

3.3.5 生理生化特征

3.4 小结

第四章 产柚苷酶细菌菌株对柚皮苷的转化特性

4.1 材料

4.1.1 菌株

4.1.2 培养基

4.1.3 药品与试剂

4.1.4 主要试验仪器与设备

4.2 试验方法

4.2.1 菌株转化动态测定

4.2.2 菌株转化能力测定

4.3 结果与分析

4.3.1 菌株对柚皮苷的转化动态

4.3.2 菌株对柚皮苷的转化能力

4.4 小结

第五章 巴氏链球菌AUH-JLD109转化条件优化研究

5.1 材料

5.1.1 菌株

5.1.2 培养基

5.1.3 药品与试剂

5.1.4 主要试验仪器与设备

5.2 试验方法

5.2.1 大肠杆菌AUH-D2-1与巴氏链球菌AUH-JLD109混合培养

5.2.2 混菌培养物在BHI培养基中对底物柚皮苷转化能力测定

5.2.3 混菌培养物在牛肉膏蛋白胨基础培养基中对底物柚皮苷转化能力测定

5.2.4 正交设计优化混合菌培养基

5.3 结果与分析

5.3.1 混菌培养物在BHI培养基中对底物柚皮苷转化能力测定

5.3.2 混菌培养物在牛肉膏蛋白胨基础培养基中对底物柚皮苷转化能力测定

5.3.3 碳源对混菌转化活性的影响

5.3.4 氮源对混菌转化活性的影响

5.3.5 金属离子对混合菌株转化活性的影响

5.3.6 磷酸盐对混菌转化活性的影响

5.3.7 正交试验

5.4 小结

结论

参考文献

在读期间发表的学术论文

作者简历

在读期间发表的学术论文

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摘要

柚皮苷(Naringin)是中药化橘红主要活性成分,柚皮素是柚皮苷脱去芸香糖基(由鼠李糖和葡萄糖组成)后形成的游离型苷元。研究表明,柚皮素具有比柚皮苷更高更广的生物学活性。利用化学方法虽能使柚皮苷的芸香糖基脱去得到柚皮素,但该方法得率较低且对环境污染较大。
  通过本研究,首次从人肠道菌群中分离得到4株能将柚皮苷转化为柚皮素的细菌菌株,分别命名为AUH-JLD3(KF374937)、AUH-JLD7(KF374938)、AUH-JLD104(KF374939)和AUH-JLD109(KF374940)。根据16S rDNA序列分析,结合形态学及相关生理生化特性等,将其分别鉴定为布劳特氏菌(Blautia sp.)AUH-JLD3、肠球菌(Enterococcus sp.)AUH-JLD7、拟杆菌(Bacteroides sp.)AUH-JLD104和巴氏链球菌(Streptococcus pasteurianus subsp.)AUH-J LD109。其中,除巴氏链球菌AUH-JLD109为兼性厌氧细菌外其余3株均为严格厌氧细菌。转化动态研究结果表明,所分离的4株细菌菌株均能在12h内将0.2mmol/L底物柚皮苷转化为柚皮素;转化能力测定结果显示,菌株AUH-JLD3、AUH-JLD7、AUH-JLD104及AUH-JLD109能够高效转化底物柚皮苷的最大浓度分别为0.2mmol/L(平均转化率66.7%)、0.8mmol/L(平均转化率86.5%)、0.2mmol/L(平均转化率73.7%)和1.6mmol/L(平均转化率93.2%)。因此,在分离的4株柚皮苷转化菌中,以兼性厌氧巴氏链球菌AUH-JLD109对底物柚皮苷转化能力最强。但菌株AUH-JLD109只能在价格昂贵的脑心浸液(BHI)培养基中正常生长转化。
  为进一步提高菌株AUH-JLD109对底物柚皮苷的转化能力,将本实验室分离保藏的大肠杆菌(Escherichia coli)AUH-D2-1与菌株AUH-JLD109进行混菌培养。研究结果表明,菌株AUH-JLD109经混合培养后在BHI培养基中能高效转化底物柚皮苷的最大浓度升高为6.4mmol/L(平均转化率为97.4%,柚皮素平均产率为89.5%)。为降低培养基成本,我们调配了价格低廉的混菌发酵培养基,并采用正交设计对混菌发酵培养基进行优化。优化后的培养基配方为:1.2%可溶性淀粉、1.5%蛋白胨、0.5%磷酸盐总量(磷酸氢二钾∶磷酸二氢钾=2∶1)和0.005%的硫酸铁,该优化培养基中混菌转化柚皮苷的最大底物浓度仍可达到6.4mmol/L,平均转化率95.3%,柚皮素的平均产率86.4%。优化培养基比BHI培养基成本可降低20倍左右。
  总之,本研究首次从人肠道菌群中分离得到4株能将柚皮苷转化为柚皮素的细菌菌株;采用混菌培养方法显著提高了巴氏链球菌AUH-JLD109对柚皮苷的转化能力,同时显著降低了培养基成本。

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