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内源性炎性物质与神经肽P物质对感觉神经元中T型钙通道的调节及其在神经元兴奋性和疼痛中的作用

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第一部分内源性炎性物质缓激肽、三磷酸腺苷、去甲肾上腺素、前列腺素2对DRG神经元中T型钙通道的作用

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第二部分P物质对T型钙通道的调节作用及机制的研究

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第三部分SP对T型钙通道的调节在神经元兴奋性及外周疼痛中作用的研究

前言

材料与方法

结果

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讨论

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参考文献

结论

综述: 神经元电压激活钙通道的氧化还原调节及其生理病理学意义

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摘要

T型钙通道（又名低电压激活钙通道，LVA）家族由三种亚型所组成：CACNA1G编码的Cav3.1，CACNA1H编码的Cav3.2，CACNA1I编码的Cav3.3。这些通道因其低电压激活特性使得其可在神经元静息膜电位附近被部分激活，并具有快激活、快失活、慢去活特性。越来越多的研究报道T型钙通道在外周痛觉通路中有重要的作用。在外周躯体感觉系统，T型钙通道主要表达于小的、TRPV1敏感的伤害性感觉神经元和低阈值机械感受器（LTMRs），包括Aδ-LTMRs和C-LTMRs。这些感受器分布于皮肤毛囊。已有研究报道，外周感觉神经元中表达的 T型钙通道亚型主要是Cav3.2亚型。Cav3.2在多种外周神经纤维中都有表达，如，皮肤传入纤维的轴突、外周伤害性感受器的神经末梢、Aδ纤维的郎飞结、脊髓背角中伤害性感受纤维的突触前末端。有研究表明，鞘内注射反义核苷酸敲低背根神经节（DRG）中的Cav3.2亚型可以显著降低神经痛和炎性痛模型的疼痛反应；T型钙通道的阻断剂在锯齿类动物疼痛模型中发挥显著的镇痛作用。T型钙通道几种亚型已被作为临床镇痛药物作用靶点研究了很长时间，且目前有几种新型的 T型钙通道特异性阻断剂作为镇痛药物已进入临床试验阶段。
　　相反，如果痛觉通路中的 T型钙通道通道活性增加或者表达量增加可以引起痛觉增敏现象。在许多病理性疼痛（如，糖尿病神经病变，外周神经损伤或炎症反应）中，均表现出 T型钙电流表达增加。虽然缓激肽（Bradykinin，BK）、三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate，ATP）、去甲肾上腺素（Norepinephrine bitartrate，NE）和前列腺素E2（Prostaglandin E2， PGE2）是已知的可以引起疼痛的炎性物质，但至今没有系统研究这些内源性物质对于 T型钙通道的调节作用，及其调节作用下的作用机制的报道。本研究第一部分将集中研究这四种内源性炎性物质对于急性分离培养的DRG神经元中的T型钙通道的调节作用，及其产生相应调节作用的机制。
　　T型钙通道（又名低电压激活钙通道，LVA）家族由三种亚型所组成：CACNA1G编码的Cav3.1，CACNA1H编码的Cav3.2，CACNA1I编码的Cav3.3。这些通道因其低电压激活特性使得其可在神经元静息膜电位附近被部分激活，并具有快激活、快失活、慢去活特性。越来越多的研究报道T型钙通道在外周痛觉通路中有重要的作用。在外周躯体感觉系统，T型钙通道主要表达于小的、TRPV1敏感的伤害性感觉神经元和低阈值机械感受器（LTMRs），包括Aδ-LTMRs和C-LTMRs。这些感受器分布于皮肤毛囊。已有研究报道，外周感觉神经元中表达的 T型钙通道亚型主要是Cav3.2亚型。Cav3.2在多种外周神经纤维中都有表达，如，皮肤传入纤维的轴突、外周伤害性感受器的神经末梢、Aδ纤维的郎飞结、脊髓背角中伤害性感受纤维的突触前末端。有研究表明，鞘内注射反义核苷酸敲低背根神经节（DRG）中的Cav3.2亚型可以显著降低神经痛和炎性痛模型的疼痛反应；T型钙通道的阻断剂在锯齿类动物疼痛模型中发挥显著的镇痛作用。T型钙通道几种亚型已被作为临床镇痛药物作用靶点研究了很长时间，且目前有几种新型的 T型钙通道特异性阻断剂作为镇痛药物已进入临床试验阶段。
　　相反，如果痛觉通路中的 T型钙通道通道活性增加或者表达量增加可以引起痛觉增敏现象。在许多病理性疼痛（如，糖尿病神经病变，外周神经损伤或炎症反应）中，均表现出 T型钙电流表达增加。虽然缓激肽（Bradykinin，BK）、三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate，ATP）、去甲肾上腺素（Norepinephrine bitartrate，NE）和前列腺素E2（Prostaglandin E2， PGE2）是已知的可以引起疼痛的炎性物质，但至今没有系统研究这些内源性物质对于 T型钙通道的调节作用，及其调节作用下的作用机制的报道。本研究第一部分将集中研究这四种内源性炎性物质对于急性分离培养的DRG神经元中的T型钙通道的调节作用，及其产生相应调节作用的机制。
　　P物质（SP）是一种十一个氨基酸多肽，属于速激肽家族，在中枢和外周神经系统均有表达。SP是一种主要的兴奋性递质，其可参与痛觉传递、肌肉收缩、炎性调节和免疫应答等过程。SP可被哺乳动物外周躯体感觉系统的伤害性感觉神经元中的TRPV1阳性细胞所大量产生。当中枢或外周受到伤害性刺激时均会释放SP。外周伤害性神经纤维末端释放SP引起所谓的“神经性炎症”，在脊髓背角SP促进兴奋性递质谷氨酸释放。SP通过激活NK1（一种G蛋白偶联受体）受体发挥胞内作用。目前尚未见有关SP调节T型钙通道功能的报道。
　　越来越多的证据表明，T型钙通道可被氧化还原机制所调节，L-型半胱氨酸等还原性物质可以显著性增大外周神经系统DRG神经元中的T型钙电流，抗坏血酸和N2O等可促进细胞释放ROS的物质可以抑制DRG神经元中的 T型钙电流等。另外具有自由电子的活性氮也可以通过氧化还原作用调节 T型钙通道功能。但至今为止，人们对这些氧化还原调节下的分子调节机制了解并不深刻。这也成为了 T型钙通道更深入研究的瓶颈。本研究第二部分主要是利用大鼠背根神经元以及人胚肾上皮（HEK）细胞研究SP对T型钙电流，尤其是Cav3.2亚型的调节作用及其作用机制。
　　因为P物质在脊髓痛觉通路中强大的兴奋性作用，针对NK1受体拮抗剂的新型镇痛药物的研究方兴未艾。然而，尽管有许多强有力的临床前数据被报道，但NK1受体拮抗剂的临床实验均以失败告终。导致这一困惑的原因可能与SP在中枢和外周有不同作用有关，即不同于其在中枢神经系统中的兴奋作用，SP在外周伤害性通路中可能存在抑制性或镇痛作用。本研究第三部分部分我们将围绕这个问题展开研究，通过传统的电生理手段研究S9SP（一种NK1受体激动剂）、Z944（T型钙通道特异性阻断剂）、ST101（T型钙通道特异性开放剂）对外周神经元DRG兴奋性的调节，并研究这些药物在整体动物疼痛中的调节作用。论文具体内容如下：
　　第一部分内源性炎性物质缓激肽、三磷酸腺苷、去甲肾上腺素、前列腺素2对DRG神经元中T型钙通道的作用
　　目的：研究几种内源性炎性物质对DRG中T型钙通道的调节及其作用机制。
　　方法：1急性分离培养大鼠 DRG神经元，药物孵育过夜。2利用膜片钳技术、细胞免疫荧光技术和PCR技术研究几种炎性物质对T型钙通道的调节及其作用机制。
　　结果：1用缓激肽（BK，100 nM），三磷酸腺苷（ATP，2μM），去甲肾上腺素（NE，500 nM），前列腺素E2（PGE2，500 nM）的混合药物(Inf.)过夜孵育培养第二天的成年雄性大鼠DRG神经元。膜片钳结果显示炎性药物混合剂孵育过夜后，与溶剂（DMEM）对照组比处理组DRG神经元中表达 T型钙通道的细胞数量显著性增加，从对照组的21/43（48.8％），上升到Inf.孵育组的31/42（73.8%）（P<0.05）。但对平均电流峰值没有显著影响，平均电流大小分别为-113.6±18.5 pA（DMEM组）和-105.3±14.5 pA（Inf.组）。Inf.孵育24 h并没有引起DRG神经元凋亡。2 BK与ATP各自单独过夜孵育也可引起T型钙电流阳性细胞比例明显增加，从对照组的25/54（46.3%）增加到43/54（79.6%，BK组）（P<0.05)和39/56（69.9%，ATP组）（P<0.05）。而NE和PGE2无此作用。且这些药物孵育对T型钙电流大小均无影响。3 PLC阻断剂U-73122或B2受体阻断剂Hoe-140孵育可阻断Inf.孵育引起的T型钙电流阳性细胞比例增大，而P2X2/P2X3阻断剂A-317491并无此作用。4蛋白酶体抑制剂MG132（5μM）可降低通道蛋白泛素化，孵育细胞并不能引起T型钙电流阳性细胞比例的增加。PCR结果显示，炎性物质单独或共孵育后， DRG神经元中Cav3.2亚型mRNA表达量并无明显变化。细胞免疫荧光结果显示，炎性物质单独或共孵育对DRG细胞中总的Cav3.2通道蛋白的表达并无影响。
　　结论：1 BK和ATP孵育可引起DRG神经元中T型钙电流阳性细胞比例增加。2 BK和ATP的作用是通过激活Gq/11-PLC通路所致。
　　第二部分 P物质对T型钙通道的调节作用及机制的研究
　　目的：研究SP（S9SP）对DRG神经元中T型钙通道的作用，应用电生理和分子生物学手段研究S9SP产生作用的分子机制。
　　方法：1使用电生理膜片钳技术观察S9SP对DRG神经元和HEK细胞中过表达的T型钙通道作用。2利用siRNA干扰技术及药理学阻断剂研究S9SP对T型钙通道调节作用偶联的G蛋白通路。3应用多种内源性或外源性药物采用电生理技术、细胞锌成像技术、原子分光光度法等技术研究S9SP引起T型钙通道功能改变的分子机制。4利用药理氧化剂及定点突变技术研究S9SP下游信号分子在通道蛋白上的具体作用位点。
　　结果：1 S9SP可以浓度依赖性地抑制中、小直径，痛觉相关的DRG神经元中的T型钙电流，IC50为6.20±2.99 nM。21μM S9SP可以产生最大抑制，抑制率为22.5±2.3%。一种 NK1受体特异性激动剂Sar9-Met(O2)11-SP（1μM）可以对DRG神经元中的T型钙电流产生相似程度的抑制，抑制率为26.6±4.7%。NK1受体特异性拮抗剂 CP-99994几乎完全阻断S9SP所引起的T型钙电流的抑制。但S9SP对DRG神经元中的高电压激活钙电流（HVA）并无影响。3 PTX预孵育过夜可完全阻断S9SP引起的对DRG神经元T型钙电流的作用。使用siRNA将Gq和G11 mRNA水平敲低至基础水平（转染阴性对照siRNA）的20%左右，发现并未对S9SP的作用造成影响，其仍可对T型钙电流产生27.1±3.8%的抑制；而当用siRNA敲低Gi和Go表达水平至基础水平（转染阴性对照siRNA）的20%左右时，S9SP对DRG神经元中T型钙电流的抑制作用则几乎完全消除，抑制率仅为2.5±2.6%。同时发现，PKC抑制剂BIM I并不能影响S9SP对T型钙电流的抑制作用。4还原性物质DTT（二硫苏糖醇）几乎完全逆转S9SP引起的T型钙电流的抑制作用；另外氧化性物质H2O2和Antimycin A可以模拟S9SP对T型钙电流的作用。5 ZnCl2可著抑制T型钙电流，抑制率为24.55±4.3%；锌存在时S9SP不能引起T型钙电流进一步的抑制。锌螯合剂TPEN可消除S9SP对T型钙电流的抑制作用，并可逆转已经发生的抑制作用。6共聚焦锌成像和原子吸收分光光度法实验表明，S9SP孵育细胞并不能改变细胞内/外锌浓度。7 S9SP存在时可增大低浓度锌对Cav3.2电流的抑制作用。8氨基酸点突变实验表明，Cav3通道上锌的高亲和位点在S9SP引起的Cav3电流抑制作用中至关重要。9利用两种氧化剂NEM（透膜的氧化剂）和MTSES（不透膜的氧化剂）的实验发现，MTSES能抑制表达于 HEK293细胞的 Cav3.2电流，且作用特点与S9SP相似；而NEM呈现非特异性抑制作用。10将Cav3.2中S1-S2胞外连接的三个连接环上的半胱氨酸和S1跨膜区的一个半胱氨酸突变为丙氨酸后发现，这四个位点的突变显著性降低了MTSES对突变通道电流的抑制作用。
　　结论：1 S9SP激活DRG神经元中NK1受体进而激活Gi/o信号通路，抑制T型钙通道；2 S9SP诱导内源性释放ROS从而通过ROS通路抑制T型钙电流。3 ROS调节通道对锌的亲和力，进而抑制T型钙电流；4同源区域I中的S1-S2连接片段中的一个或几个半胱氨酸介导了Cav3.2的氧化还原作用。
　　第三部分 SP对 T型钙通道的调节在神经元兴奋性及外周疼痛中作用的研究
　　目的：研究SP介导的T型钙通道的调节在大鼠DRG神经元兴奋性及动物疼痛行为中的作用。
　　方法：1使用电流钳技术，研究 T型钙通道特异性阻断剂 Z944、T型钙通道特异性开放剂ST101和NK1受体激动剂S9SP对DRG神经元兴奋性的影响。2动物疼痛模型由大鼠脚掌注射缓激肽（BK）、机械刺激或热源刺激所造成。在这些疼痛模型上观察脚掌注射Z944、S9SP和ST101对疼痛行为的影响。3鞘内注射反义核苷酸敲低大鼠DRG（L4-L6）中的Cav3.2表达水平，进一步研究T型钙通道在S9SP对疼痛行为影响中的作用。
　　结果：1 Z944可以显著增加动作电位的rheobase，减少动作电位（AP）个数，并且使静息膜电位（Erest）超极化，但对 AP峰值和 AP持续时间没有显著影响。相反，ST101可以显著增加动作电位爆发次数并使 Erest去极化，同样对AP峰值和AP时程没有显著影响。S9SP对DRG神经元兴奋性的影响与Z944作用趋势相同，虽然只有对rheobase的作用达到了统计学差异。siRNA敲低培养DRG神经元中Cav3.2表达可以消除Z944和ST101对神经元兴奋性的影响。2 BK单独灌流可以显著降低rheobase，增加动作电位爆发个数，使Erest去极化。S9SP和Z944则可抑制BK的作用，都几乎使BK引起的rheobase降低和动作电位个数增加恢复至原来水平。3大鼠脚掌分别注射0.02μM，0.2μM，2μM和200μM ST101可以引起明显的疼痛反应。4大鼠脚掌注射Z944（1μM，10μM，100μM）三个不同浓度均可显著性增加大鼠热痛阈值。5大鼠脚掌注射S9SP可以显著降低大鼠脚掌对轻触觉的反应，Z944脚掌注射产生相似的作用；大鼠脚掌注射ST101可以增加大鼠脚掌对轻触觉的敏感程度。6提前注射RTG（M-型钾通道开放剂）或Z944可以显著降低之后注射BK所引起的疼痛，预注射S9SP同样显著降低BK注射引起的疼痛反应。RTG和Z944共同预注射可以引起与S9SP注射相似的镇痛反应。7利用反义核苷酸鞘内注射敲低大鼠DRG中Cav3.2水平可以消除Z944引起的镇痛作用，降低S9SP引起的镇痛作用，提示T型钙通道的参与。
　　结论：1 T型钙通道开放剂ST101可增加神经元兴奋性，而T型钙通道阻断剂Z944和S9SP可降低神经元兴奋性；ST101和Z944的作用是通过调节T型钙通道功能产生的。Z944和S9SP可以拮抗BK引起的DRG神经元兴奋性的增加。2 ST101引起大鼠自发性疼痛；Z944和S9SP可拮抗BK注射引起的疼痛。3 Cav3.2介导了Z944引起的镇痛作用，介导了部分S9SP的镇痛作用。

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