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人乳头瘤病毒抑制FAS介导的凋亡通路在食管鳞状细胞癌中的作用机制

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前言

材料与方法

1 材料

1.1 研究对象

1.2 主要材料与试剂

1.3 细胞培养

1.4 质粒转染

1.5 western blot

1.6 Real Time-PCR

1.7主要仪器

2 实验方法

2.1 蜡块实验

2.2 细胞实验

2.3 质粒合成、转化、提取和测序。

2.4 质粒转染

2.5 Real time-PCR检测细胞mRNA的表达

2.6 Western Blot法检测目的基因于蛋白水平的表达变化情况

3 统计学分析

结果

1.1食管鳞状细胞癌（ESCC）病理形态学观察结果与临床病理分析

1.2 ESCC中HPV的感染情况与临床病理特征的关系

2．免疫组化结果

2.1 ESCC组织中FADD、caspase-8蛋白表达情况

2.2 ESCC组织中FADD、caspase-8蛋白表达与HPV的关系

2.3 ESCC组织中FADD和caspase-8蛋白表达与临床病理特征的关系

2.4 HPV与FADD和caspase-8蛋白表达与临床病理特征的关系

3 细胞实验

3.1 RT-PCR结果显示：

2.4 Western blot结果显示：

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述:人乳头瘤病毒在肿瘤中的作用

致谢

个人简历

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摘要

目的：我国是食管癌（EsophagealCarcinoma，EC）的高发地区，每年因食管癌死亡者大约15万人，约占全部恶性肿瘤死亡数的近四分之一。我国食管癌人口死亡率最低的为云南省(105/10万)，与死亡率最高的河南省相差31倍，可见食管癌的发病率存在明显的地域差异。近年来，环境致癌因素（如真菌毒素、病毒等）在各类肿瘤的发生发展中已成为研究热点之一。人类乳头瘤病毒（HumanpapillomavirusHPV）与食管癌发生的关系最早是1982年由Syrjanen提出，他的研究发现40％(24/60)的食管癌发生的组织学形态改变与生殖道湿疣改变极其相似，随后他与同事用免疫组织化学法在食管鳞状上皮细胞癌（EsophagealsquamousCellCarcinoma，ESCC）中发现了HPV的结构蛋白。HPV作为重要致癌因素在宫颈癌发生中的作用已得到证实。随着研究的深入，有学者发现口腔、食管鳞状细胞癌的发生还与HPV感染有关。2008年，WHO认定HPV感染与人口咽部鳞状细胞癌发生存在直接关系。然而HPV与食管鳞状细胞癌的发生关系及其作用尚未阐明。
　　Fas属于肿瘤坏死因子和神经生长因子受体家族成员，当Fas与它相应配体FasL(CD95L)结合后，Fas受体三聚体化而活化，激活的受体与FADD结合，再与caspase-8相互作用使后者活化，形成死亡诱导信号复合物，再激活一系列的Caspase-1,3,7等，其中Caspase-3的切割底物为PARP，调控凋亡最终步骤的执行。FADD作为Fas通路的关键蛋白，可以触发凋亡级联反应。研究发现在人结肠腺癌细胞系HCT116细胞中高表达HPV16E6，可以通过影响TRAIL蛋白介导的凋亡信号途径，避免宿主细胞凋亡。研究还发现HPVE6蛋白可以诱导FADD和caspase-8的泛素化，从而抑制Fas信号通路的激活来抑制细胞凋亡的发生。
　　我们在前期实验中已经了解到HPV感染可以降低食管鳞状细胞癌中Fas蛋白的表达，为进一步明确HPV在食管鳞状细胞癌发生发展中的作用，本研究首先明确我省食管鳞状细胞癌组织中FADD、caspase-8蛋白的表达情况，分析HPV感染与FADD、caspase-8蛋白表达的关系，其次对正常食管上皮细胞和高分化食管鳞状细胞癌细胞株转染携带HPV16E6基因片段的质粒，在过表达E6蛋白的情况下观察Fas/FasL凋亡通路相关蛋白（Fas/FasL、FADD、caspase-8）的变化情况。在整体水平和细胞水平探讨HPV对Fas介导的细胞凋亡通路相关蛋白的影响，从细胞凋亡角度进一步阐明HPV与食管癌发生的关系及其作用机制，为食管癌发生的病毒学机制的研究提供新的思路和视角，为食管癌的临床治疗、预后判断和预防提供科学依据。
　　方法：
　　1、标本收集
　　收集河北医科大学第二医院2009年1月到2015年12月间符合条件的食管鳞状细胞癌（原发性食管鳞状细胞癌，手术前未经放疗和化疗）的石蜡标本，共159例。收集临床病理资料，包括年龄，性别，淋巴结转移情况和癌组织的分化程度。
　　2、检测病毒DNA
　　将石蜡组织切成薄片，使用石蜡组织DNA提取盒提取组织DNA。
　　以HPVL1基因MY09/MY11为引物，用PCR方法检测各实验组与对照组中HPVL1基因的存在。使用?-actin作为内参，使用三蒸水代替引物完成PCR反应，作为阴性对照，使用确诊HPV阳性的宫颈癌石蜡组织提取的DNA作为阳性对照。
　　3、检测食管鳞状细胞癌组织的FADD、caspase-8蛋白表达情况
　　应用免疫组化SP法检测食管鳞状细胞癌组织中FADD、caspase-8蛋白表达情况，FADD、caspase-8蛋白阳性反应均定位于细胞质。
　　4、EX-GS3066-M90(HPV16E6)、EX-NEG-M90(空载)质粒提纯及浓度检测。
　　5、HPV16E6质粒转染对体外培养的Het-1A（人正常食管上皮细胞）和Eca-109（人食管高分化鳞状细胞癌株）的Fas介导凋亡通路相关蛋白（Fas/FasL、FADD、caspase-8）的影响。
　　体外培养Het-1A和Eca-109，转染HPV16E6质粒和空载质粒（阴性对照），应用半定量RT-PCR、Westernblot方法分别检测两组Het-1A和Eca-109细胞FADD、caspase-8的mRNA和蛋白表达变化情况，分析HPV16E6蛋白对Fas凋亡通路的可能影响和机制。
　　为了进一步明确HPV16E6对人食管正常上皮Fas介导的凋亡通路的影响，转染Het-1A后于12h、24h、48h收集细胞，观察细胞内Fas/FasL、FADD和caspase-8蛋白表达在转染后的变化趋势。
　　6、统计分析所有数据采用SPSS19.0软件，计数资料采用χ2检验及Pearson相关分析法，P<0.05认为差异有统计学意义。计量资料以均数±标准差表示，单因素方差分析P<0.05时认为差异有统计学意义。
　　结果：
　　1.1食管鳞状细胞癌（ESCC）病理形态学观察结果与临床病理分析
　　本组ESCC病例共159例，年龄跨度为27-87岁，中位数为62岁；男性患者124例，女性患者35例；经病理形态学观察：淋巴结转移患者47例；ESCC高分化患者39例，中分化72例，低分化48例。低分化组与高中分化组的淋巴结转移率无明显差异（P>0.05）。
　　1.2ESCC组织中HPV的感染情况与临床病理特征的关系
　　159例ESCC的HPV感染率为32.1%。HPV阳性组高中分化鳞癌占56.9%，明显低于HPV阴性组的75.9%；HPV阳性组低分化鳞癌占43.1%，明显高于HPV阴性组的24.1%（P<0.05）；HPV感染与年龄，性别，淋巴结转移之间无明显差异（P>0.05）。
　　2、免疫组化结果
　　2.1ESCC组织中FADD、caspase-8蛋白表达情况
　　159例ESCC组织中FADD蛋白表达阳性81例，阴性78例；caspase-8蛋白表达阳性93例，阴性66例。癌旁组织中FADD蛋白表达阳性150例，阴性9例；caspase-8蛋白表达阳性131例，阴性28例。FADD和caspase-8在ESCC组织中蛋白表达的阳性率分别为50.9%和58.5%，明显低于癌旁组织的94.3%和82.4%（P<0.05）。
　　2.2ESCC组织中FADD、caspase-8蛋白表达与HPV的关系
　　HPV阳性组FADD蛋白表达阳性19例，阴性32例，caspase-8蛋白表达阳性24例，阴性27例；HPV阴性组FADD蛋白表达阳性62例，阴性46例；caspase-8蛋白表达阳性69例，阴性39例，FADD和caspase-8在HPV阳性组蛋白表达的阳性率分别为37.3%和47.1%，明显低于阴性组的57.4%和63.9%（P<0.05）。
　　2.3ESCC组织中FADD和caspase-8蛋白表达与临床病理特征的关系
　　男性FADD蛋白表达阳性率为59.7%，明显高于女性的20.0%（P<0.05）；FADD蛋白表达与年龄，淋巴结转移及肿瘤分化程度之间无明显差异（P>0.05）。
　　男性caspase-8蛋白表达阳性率63.7%，明显高于女性的40.0%（P<0.05）；caspase-8蛋白表达与年龄，淋巴结转移及肿瘤分化程度之间无明显差异（P>0.05）。
　　2.4HPV与FADD和caspase-8蛋白表达与临床病理特征的关系
　　HPV感染阳性的ESCC组织：62岁以上(包括62岁)患者FADD蛋白阳性表达率24.1%，明显低于62岁以下患者的54.5%（P<0.05）；低分化组FADD蛋白阳性表达率为13.6%，明显低于高中分化的55.2%；FADD蛋白表达与性别和淋巴结转移之间无明显差异（P>0.05）。
　　HPV感染阳性的ESCC组织：低分化组caspase-8蛋白阳性率为27.3%，明显低于高中分化组的62.1%（P<0.05），caspase-8蛋白表达与年龄，性别和淋巴结转移之间无明显差异（P>0.05）。
　　3、细胞实验
　　转染后HPV16E6、Fas、FasL、FADD、caspase-8蛋白表达情况
　　3.1RT-PCR结果显示：
　　Het-1A细胞转染E6基因后与空载质粒组相比，E6基因相对表达升高（P<0.05）；FADD、caspase-8基因相对表达量降低（P<0.05）；Fas基因相对表达量升高（P<0.05）；FasL无明显变化（P>0.05）。
　　Eca-109细胞转染E6基因后与空载质粒组相比，E6基因相对表达量升高（P<0.05）；FADD、caspase-8、Fas基因相对表达量升高（P<0.05）；FasL无明显变化（P>0.05）。
　　Het-1A细胞转染E6基因后与空载质粒组相比，E6基因在12h、24h和48h相对表达量呈上升趋势（P<0.05）；FADD和caspase-8基因在12h、24h和48h相对表达量呈下降趋势（P<0.05）；Fas基因在12h、24h和48h相对表达量呈上升趋势（P<0.05）；FasL无明显变化（P>0.05）。
　　3.2Westernblot结果显示：
　　Het-1A细胞转染E6基因后与空载质粒组相比，E6蛋白相对表达升高（P<0.05）；FADD、caspase-8、Fas蛋白相对表达量降低（P<0.05）；FasL无明显变化（P>0.05）。
　　Eca-109细胞转染E6基因后与空载质粒组相比，E6蛋白相对表达量升高（P<0.05）；FADD、caspase-8、Fas蛋白相对表达量降低（P<0.05）；FasL无明显变化（P>0.05）。
　　Het-1A细胞转染E6基因后与空载质粒组相比，E6蛋白在12h、24h和48h相对表达量呈上升趋势（P<0.05）；FADD和caspase-8蛋白在12h、24h和48h相对表达量呈下降趋势（P<0.05）；Fas蛋白在12h和24h相对表达量升高（P<0.05），在48h相对表达量降低（P<0.05）；FasL无明显变化（P>0.05）。
　　结论：
　　1、本组食管鳞状细胞癌组织HPV的检出率为32.1%，HPV阳性的癌组织中低分化鳞状细胞癌所占比例高于HPV阴性组，提示HPV与肿瘤分化存在相关关系。
　　2、食管鳞状细胞癌中FADD和caspase-8蛋白表达降低，而且HPV可进一步降低两者的蛋白表达水平。
　　3、HPV16E6基因可以降低Het-1A和Eca-109细胞FADD、caspase-8、和Fas蛋白表达水平。
　　4、组织学和细胞学水平研究结果提示，HPV可能通过抑制FAS介导的凋亡通路，在食管鳞状细胞癌发生发展中发挥一定作用。

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