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吡格列酮对非酒精性能脂肪性肝病大鼠脂滴代谢及Perilipin蛋白表达的预防作用

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目的:非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic Fatty Liver Disease，NAFLD)的概念于上世纪八十年代提出，是指无酒精摄入过多(＜20g/d)及其他外源性肝脏损伤因子情况下而发生的以脂肪在肝细胞中蓄积至弥漫性肝细胞脂肪变性为主要病理特征的的一组临床综合征。NAFLD的发病具有遗传-环境-代谢模式，其疾病谱包含从单纯性脂肪变到非酒精性脂肪性肝炎(Nonalcoholic steatohepatitis，NASH)，再进一步发展至NASH相关肝硬化和肝细胞癌。目前，NAFLD存在于10％-24％的全部人群中，而在肥胖人群中发病率已上升到75％。在美国几乎3.01亿的肥胖人群有脂肪变，860万的肥胖人群有脂肪性肝炎。越来越多的证据表明NAFLD是肥胖、高胰岛素血症、外周胰岛素抵抗、血糖异常或糖尿病、高甘油三酯血症、高血压等代谢综合征在肝脏的表现。近年来，随着生活方式的变化，尤其是饮食结构变化和体育锻炼的减少，NAFLD病人逐年增多，年龄结构日益年轻化，因此NAFLD已经成为全球公认的健康问题。到目前为止，NAFLD发病机制尚未完全阐明，深入探索NAFLD发病机制从而为其防治提供新的靶点，已经成为广大医务工作者迫切解决的问题。
　　肝脏脂肪变涉及到过多的脂质积累，主要是甘油三酯(triglyceride，TG)，它是NAFLD的主要标志。脂质主要以TG的形式储存在肝细胞脂滴中。脂滴是球形的细胞器以中性脂质为中心，表面由磷脂单层和很多特殊的蛋白覆盖。脂滴以TG的形式短暂储存脂肪酸，在脂质稳态中起重要作用。过多脂滴在非脂肪组织例如肝脏、冠状动脉、胰岛中积累，易形成脂肪肝、冠心病、2型糖尿病等代谢性疾病。脂滴表面蛋白在脂质代谢、转运、细胞内交换、信号转导和细胞骨架方面起重要作用。研究最多的和最丰富的脂滴表面蛋白是PAT家族蛋白，它们具有类似的序列并且都定位在脂滴中。以前研究表明PAT家族蛋白在脂肪组织、类固醇生成细胞、乳腺组织、酒精性肝病中表达。相关研究发现PAT家族蛋白与NAFLD也有关系。PAT家族蛋白包括:perilipin1(perilipin)、perilipin2（ADRP）、 perilipin3(TIP47)、perilipin4(S3-12)、perilipin5(OXPAT)。近年来人们对perilipin与肥胖、糖尿病、胰岛素抵抗、动脉粥样硬化、肿瘤之的关系研究的越来越多，但关于perilipin蛋白表达与脂滴代谢及NAFLD之间的关系研究的还比较少。因此本实验运用高脂饮食建立NAFLD模型，给予吡格列酮干预，研究它们之间的关系，从而进一步阐明NAFLD发病机制，为其防治提供潜在的靶点。
　　方法:1、选用雄性SD(Sprague Dawley)大鼠24只，体重180±20 g，普通饲料喂养1周后，随机分成3组:正常对照组(NC group，n=8)、高脂饮食组（HF group，n=8）、药物预防组(DP group，n=8)。
　　2、正常对照组给予普通饲料饮食8周，高脂饮食组给予高脂饮食（82.5％普通饲料、2％胆固醇、10％猪油、5％蛋黄粉、0.5％胆酸钠）和等容量的生理盐水灌胃8周;药物预防组给予高脂饮食同时吡格列酮(4mg/kg/d)灌胃8周;每周称取大鼠体重并记录1次，于8周末时处死所有大鼠。
　　3、将大鼠肝脏完整分离取出，观察肝脏大体情况，称取肝脏湿重并计算肝指数;留取大鼠血清样本，用全自动生化分析仪测定血清生化指标:血清甘油三酯(triglyceride，TG)、胆固醇(cholesterol，TC)、高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT），天冬氨酸氨基转移酶(aspartateaminotransferase，AST);使用铜试剂显色法测定血清未酯化游离脂肪酸(nonestesterified free fatty acid NEFFA)及肝组织游离脂肪酸;使用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin HE)染色在光镜下观察肝脏组织病理变化;使用免疫组织化学（immunohistochemical IHC）染色方法检测各组大鼠perilipin在肝组织中的表达;用western-blot方法测定各组大鼠肝组织perilipin蛋白含量。
　　结果:
　　1、各组大鼠体重;肝湿重;肝指数的变化
　　1.1体重
　　1周末各组大鼠体重无明显差异。8周末时，与正常对照组(411.54±35.16)(g)相比，高脂组（455.62±30.95）和药物预防组(448.23±28.01)体重明显增加(P＜0.05);与高脂组相比，药物预防组体重略减轻，但两者没有明显差异(P=0.64＞0.05)。
　　1.2肝湿重
　　与正常对照组(11.51±2.08)(g)相比，高脂组(23.65±3.13)和药物预防组(20.30±3.16)肝湿重明显高于正常对照组(P＜0.05);与高脂组相比，药物预防组肝湿重明显降低(P＜0.05)。
　　1.3肝指数
　　与正常对照组(2.76±0.36)(％)相比，高脂组(5.20±0.63)和药物预防组(4.47±0.60)肝指数明显升高（P＜0.05）;与高脂组相比，药物预防组肝指数降低(P＜0.05)。
　　2、血清生化指标的比较
　　2.1血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)
　　与正常对照组(0.43±0.30)(mmol/L)相比，高脂组血清TG(0.81±0.25)明显升高(P＜0.05);药物预防组(0.45±0.34)明显低于高脂组(P＜0.05)，较正常对照组略升高，但无统计学差异(P=0.889＞0.05);与正常对照组(1.64±0.31)(mmol/L)相比，高脂组血清TC(2.65±0.50)明显升高;药物预防组TC(2.17±0.53)明显低于高脂组(P＜0.05)，而较正常对照组升高(P＜0.05)。
　　2.2血清高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白(LDL-C)
　　高脂组血清HDL-C(0.71±0.24)(mmol/L)较正常对照组(0.99±0.27)明显降低（P＜0.05），药物预防组HDL-C(0.66±0.22)较高脂组降低，但无统计学差异(P=0.69＞0.05)。高脂组血清LDL-C(1.66±0.40)(mmol/L)明显高于正常对照组(0.97±0.25)(P＜0.05)，药物预防组LDL-C(1.09±0.39)较高脂组降低(P＜0.05)，而仍高于正常对照组，但无统计学差异(P=0.52＞0.05)。
　　2.3血清游离脂肪酸(FFA)
　　高脂组血清FFA（731.7±49.59）（μmol/L）明显高于正常对照组(641.05±50.94)(P＜0.05)，药物预防组血清FFA（655.58±48.07）明显低于高脂组（P＜0.05），略高于正常对照组，但无统计学差异(P=0.56＞0.05)。
　　2.4血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)
　　高脂组ALT（70.02±19.45）(U/L)较正常组（23.33±7.26）显著升高(P＜0.05)，而药物预防组（44.96±12.40）较高脂组显著降低(P＜0.05);高脂组AST(182.02±17.91)(U/L)较正常对照组(99.59±7.10)明显增高(P＜0.05)，药物预防组AST(144.33±22.34)较高脂组明显下降(P＜0.05)。
　　3、肝组织游离脂肪酸(FFA)的比较
　　与正常对照组肝组织FFA(84.10±9.21)(μmol/L/gprot)相比，高脂组(223.37±21.28)和药物预防组(137.23±28.92)明显升高(P＜0.05);与高脂组相比，药物预防组FFA明显降低(P＜0.05)。
　　4、肝脏大体情况及病理变化
　　正常对照组大鼠肝脏光滑、有光泽，呈红褐色，HE染色未发现肝细胞脂肪变性及炎症细胞浸润;高脂组大鼠肝脏无光泽，表面不平，触之有油腻感，呈深黄色，HE染色可见肝细胞内有大小不等的脂滴，有些区域肝小叶内及汇管区炎症细胞浸润、肝细胞出现不同程度的坏死;药物预防组大鼠肝细胞脂肪变性程度较高脂组明显改善。
　　5、各组大鼠肝组织perilipin免疫组化比较
　　表达perilipin的阳性细胞呈棕黄色，正常组大鼠肝组织perilipin表达于肝细胞膜上，高脂组和药物预防组perilipin不仅表达于肝细胞膜上，也表达于较大脂滴上。
　　6、各组大鼠肝组织perilipin蛋白表达的比较
　　高脂组perilipin蛋白(0.84±0.05)显著高于正常对照组(0.55±0.06)(P＜0.05);药物预防组(0.61±0.06)明显低于高脂组(P＜0.05)，与正常对照组相比略高，但无统计学差异(P=0.14＞0.05)。
　　结论:
　　1、高脂饮食可以成功建立大鼠非酒精性脂肪性肝病模型。
　　2、高脂饮食组大鼠肝组织perilipin蛋白表达增多，同时血清TG、FFA升高，表明perilipin与脂质代谢紊乱相关。Perilipin主要位于较大脂滴和肝细胞膜上，因此perilipin与脂滴成熟、大小密切相关，降低perilipin表达可能会阻止NAFLD进展。
　　3、吡格列酮降低血清TG、FFA，从而改善脂质代谢紊乱;降低肝组织中perilipin蛋白表达，可使肝组织中脂滴数量减少、脂滴变小，肝细胞脂肪变及炎症程度改善。

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