大鼠弥漫性脑创伤中海马区星形胶质细胞p-Cx43与神经元自噬的相互调控作用及分子机制研究

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创伤性脑损伤(Traumatic brain injury, TBI)是青壮年人群的主要死因，也是现代社会最主要的住院原因之一。外力损伤神经元启动一系列分子事件，导致脑组织水肿，神经元死亡，运动和认知功能受损。脑外伤后神经元自噬激活，加剧了脑损伤及神经功能缺失。神经元自噬参与了脑损伤的病理进程，但是关于神经元自噬的调控机制的研究甚少。目前国内外研究主要集中于神经元内的信号转导通路，关于神经胶质细胞对神经元自噬的调控以及神经元自噬对神经胶质细胞的影响未见报道。
　　近年来研究发现，TBI引起星形胶质细胞缝隙连接蛋白(connexin，Cx)表达明显升高，进而影响其形成的缝隙连接允许细胞内小分子，离子及代谢物交换;TBI也引起星形胶质细胞P2X7受体激活，导致脑水肿及神经损伤;TBI所引起神经胶质细胞膜上的谷氨酸转运体1蛋白（glial glutamatetransporter1，GLT-1）表达下调，导致细胞外兴奋性氨基酸浓度升高，损伤神经元。但是关于星形胶质细胞缝隙连接蛋白如何调控P2X7受体及谷氨酸转运体，从而导致神经元自噬激活，影响突触后电位的机制还未阐明。同时神经元自噬激活是否对星形胶质细胞的缝隙连接蛋白具有降解作用，从而自我调控，具有神经保护功能，目前不得而知。本论文分三部分阐述。
　　第一部分大鼠弥漫性脑创伤中海马区星形胶质细胞p-Cx43对神经元自噬的调控
　　目的:本部分研究选用成年SPF级雄性SD大鼠应用改良Marmarou法制备闭合性弥漫性颅脑创伤大鼠模型，给予p-Cx43特异性抑制剂甘珀酸(carbenoxolone，CBX)干预，检测弥漫性脑创伤大鼠海马区星形胶质细胞中p-Cx43对神经元自噬的影响。
　　方法:采用本实验室改良Marmarou方法复制TBI大鼠模型。成年SPF级SD雄性大鼠192只数字随机分组:①假手术组（Sham group）;②脑创伤组(TBI group);③脑创伤+溶剂组（Saline group）;④脑创伤+Carbenoxolone组(CBX group)。取伤后3h、6h、24 h、48h4个时间点检测下列指标:①HE染色观察各组脑组织病理形态学改变;②免疫组织化学方法检测海马区p-Cx43和微管相关轻链-3(microtubule associatedproteinllight chain3，LC3)的蛋白定位表达;③Western-blot法检测海马区p-Cx43和LC3Ⅱ的蛋白表达;④免疫荧光双标法检测海马区p-Cx43和LC3的蛋白共定位情况。应用Image Proplus6.0，Image J和Image Lab4.1分析系统进行定量分析测定。实验中数据均用(x)±s表示，用SPSS16.0统计软件进行方差分析，两两比较采用Dunnett-t检验，以P＜0.05，表示差异有统计学意义。
　　结果:
　　1、光镜下观察大鼠脑创伤模型切片
　　1.1伤后大鼠脑组织大体观察:伤后可见蛛网膜下腔出血以及少量脑室出血;脑实质多见点状出血，以脑干的背侧多见，脑组织表面血管充血明显，并可见脑组织肿胀及局部脑挫伤。
　　1.2 HE染色观察组织形态学的改变:Sham组大鼠海马区细胞形态结构正常，排列整齐，神经元数量多且形态正常;TBI24 h组和Saline溶剂组神经元胞体肿胀明显，胞浆染色浅淡，核皱缩浓染，细胞与细胞之间出现间隙，神经元出现变性及坏死改变。CBX治疗组较TBI组和Saline溶剂组相比，神经元胞体肿胀缓解，及核浓缩明显减轻，神经元周围间隙明显较小。
　　2、海马区p-Cx43和LC3免疫组化检测结果
　　p-Cx43定位于海马区星形胶质细胞的胞质和胞膜中，Sham组偶见阳性细胞，着色浅淡。TBI24 h组和Saline溶剂组与Sham组比较，伤后p-Cx43阳性细胞显著增多，着棕色加深，免疫反应性增强(P＜0.05)。CBX治疗组p-Cx43免疫反应性明显减弱(P＜0.05);LC3定位于海马区神经元的胞质，Sham组可见少量阳性细胞，且胞浆着色浅淡。TBI24 h组和Saline溶剂组与Sham组比较，LC3阳性细胞数明显增多，胞浆呈现深棕色，免疫反应性明显增强(P＜0.05)。与TBI组和Saline溶剂组相比，CBX治疗组LC3免疫反应性明显减弱(P＜0.05)。
　　3、海马区p-Cx43和LC3的Westem blot检测结果
　　Sham组p-Cx43蛋白表达量在各时间点无变化;TBI组和Saline溶剂组p-Cx43蛋白表达量随着伤后时间的推移，逐渐增高，与Sham组比较，伤后3h开始显著升高(P＜0.05)，6h达高峰，高表达状态持续至伤后24 h(P＜0.05)。CBX治疗组各时间点蛋白表达趋势与TBI和Saline组相似，但表达量明显降低(P＜0.05)。Cx43总蛋白表达量在脑创伤后各时间点无变化。Sham组LC3Ⅱ的有微量的蛋白表达，且各时间点无差异;与Sham组相应时间点比较，TBI组和Saline溶剂组LC3Ⅱ的蛋白表达量显著升高(P＜0.05)，且呈现一定的动态变化趋势，于损伤6h开始升高，24h达高峰，持续至伤后48h。CBX治疗组各时间点蛋白表达趋势与TBI和Saline组相似，但LC3ⅡI表达量明显降低(P＜0.05)。
　　4、TBI后海马区LC3与神经元特异性标记物(neuronal nuclei，NeuN)以及p-Cx43与星形胶质细胞特异性标记物（glial fibrillary acidic protein，GFAP）荧光双标检测结果
　　激光共聚焦显微镜下可见LC3为DyLight488标记的细胞胞浆绿色荧光，NeuN为DyLight594标记的细胞核周红色荧光。可见海马区绿色荧光与红色荧光大部分重叠，呈现橙色聚集，并基本完全重合，说明自噬主要发生在神经元。激光共聚焦显微镜下P-Cx43为DyLight488标记的细胞胞浆绿色荧光，GFAP为DyLight594标记的星形胶质细胞红色荧光，在海马区重叠呈橙色聚集，说明P-Cx43定位于星形胶质细胞。
　　小结:改良的Marmarou弥漫性脑创伤模型满足了本实验对P-Cx43和LC3的研究;大鼠脑创伤后，P-Cx43和LC3蛋白表达持续升高，并且免疫反应性增强，P-Cx43定位于海马区星形胶质细胞，LC3定位于海马区神经元细胞，给予缝隙连接阻断剂CBX同时抑制P-Cx43和LC3蛋白表达及免疫反应性，改善了脑损伤后神经元肿胀及核浓缩，具有一定的神经保护作用。
　　第二部分大鼠弥漫性脑创伤中海马区星形胶质细胞p-Cx43通过激活P2RX7和下调GLT-1表达对神经元自噬调控的分子机制研究
　　目的:p-Cx43如何通过P2RX7和谷氨酸转运体GLT-1调控神经元自噬，以及对海马兴奋性突触后电位和空间学习记忆的影响。
　　方法:大鼠模型同上，将156只成年SPF级雄性SD大鼠随机分成6组:①假手术组(n=36)，②脑创伤组(n=66)③脑创伤24 h+Saline溶剂组(n=24)(④脑创伤24 h+CBX抑制剂组(n=6)⑤脑创伤24h+OxATP抑制剂组(n=12)⑥脑创伤24h+Ceftriaxone组(n=12)。术后时间点同上。检测①免疫组织化学法检测海马区P2X7、GLT-1的蛋白表达、定位;②激光共聚焦法检测p-Cx43、P2X7、GLT-1的蛋白共定位情况;③Western-blot法检测P2X7、GLT-1和LC3的蛋白表达量。另取30只大鼠随机分为假手术组、脑创伤24 h组，脑创伤24 h+Saline溶剂组，脑创伤24 h+CBX抑制剂组，脑创伤24 h+3-MA(3-methyladenine)抑制剂组，记录海马脑片兴奋性突触后电位，Clampfit10.0检测其长时程增强(LTP,long-term potentiation)的变化。再取30只大鼠行水迷宫测试，随机分为假手术组、脑创伤14d组，脑创伤14 d+Saline溶剂组，脑创伤14 d+CBX抑制剂组，脑创伤14 d+3-MA抑制剂组，检测其空间学习记忆能力，使用Smart软件记录分析潜伏期。定量分析和统计同上。
　　结果:
　　1、Morris水迷宫结果
　　使用Morris水迷宫检测大鼠空间学习记忆能力。TBI组和Saline溶剂组伤后第14 d较Sham组相比大鼠搜索安全岛潜伏期明显延长(P＜0.05)。CBX抑制剂组和3-MA抑制剂组伤后第14 d搜索安全岛运动轨迹均较TBI组和Saline溶剂组明显改善，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　2、长时程增强(LTP)结果
　　使用长时程增强检测长时记忆有重要意义。TBI24 h组和Saline溶剂组伤后兴奋性突触后电位幅度、斜率较Sham组均明显降低、减小，组间差异有统计学意义(P＜0.05)。CBX抑制剂组和3-MA抑制剂组伤后突触后电位幅度、斜率均较TBI24 h组和 Saline溶剂组明显增高、加大,差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　3、海马区P2X7受体和GLT-1免疫组化检测结果
　　P2X7受体定位于海马区星形胶质细胞的细胞膜上，Sham组可见阳性细胞，着棕色。TBI24 h组和Saline溶剂组与Sham组比较，伤后P2X7受体阳性细胞无显著增多(P＞0.05)。OxATP治疗组P2X7受体免疫反应性无明显改变(P＞0.05);GLT-1定位于海马区星形胶质细胞细胞膜，Sham组可见阳性细胞，着棕色。TBI24 h组和Saline溶剂组与Sham组比较，伤后GLT-1阳性细胞数显著减少，胞膜呈现浅棕色，免疫反应性减弱(P＜0.05)。Cef治疗组GLT-1免疫反应性明显增强(P＜0.05)。
　　4、脑创伤后24 h海马区P-Cx43、P2X7、GLT-1与GFAP的激光共聚焦检测结果
　　海马区p-Cx43为DyLight647标记的阳性细胞胞浆紫色荧光，P2X7为DyLight488标记的阳性细胞胞膜为绿色荧光，星形胶质细胞标记物GFAP为DyLight594标记的红色荧光，三色Merge呈黄色，说明p-Cx43、P2X7共定位于星形胶质细胞;海马区GLT-1为DyLight647标记阳性细胞胞膜为紫色荧光，P2X7为DyLight488标记阳性细胞胞膜为绿色荧光，星形胶质细胞标记物GFAP为DyLight594标记红色荧光，三色Merge呈黄色，说明GLT-1、P2X7也共定位于星形胶质细胞。
　　5、Western blot检测结果
　　TBI24 h组和Saline溶剂组与Sham组相比LC3Ⅱ的蛋白表达量升高，组间差异有统计学意义(P＜0.05);TBI24 h+CBX抑制剂组、OxATP抑制剂组、Ceftriaxone组LC3Ⅱ的蛋白表达与TBI24 h组和Saline溶剂组相比表达量下降，组间差异有统计学意义(P＜0.05)。TBI组与Sham组比较，伤后6 h GLT-1蛋白量显著降低(P＜0.05)，伤后24 h达高峰;TBI24 h组和Saline溶剂组与Sham组相比GLT-1的蛋白表达量降低，组间差异有统计学意义(P＜0.05); TBI24 h+CBX抑制剂组、OxATP抑制剂组GLT-1的蛋白表达与TBI24 h组和Saline溶剂组相比表达量升高，组间差异有统计学意义(P＜0.05)。TBI组与Sham组比较，伤后P2X7蛋白量无显著变化(P＞0.05); TBI24 h组和Saline溶剂组与Sham组相比P2X7的蛋白表达量无组间差异(P＞0.05); TBI24 h+CBX抑制剂组P2X7的蛋白表达与TBI24h组和 Saline溶剂组相比组间无差异(P＞0.05)。
　　小结:大鼠弥漫性脑创伤后海马区星形胶质细胞p-Cx43通过激活P2X7受体，下调GLT-1蛋白表达，调控神经元自噬，从而影响海马区长时程记忆及空间学习记忆能力。
　　第三部分大鼠弥漫性脑创伤中海马区神经元自噬对星形胶质p-Cx43降解作用
　　目的:通过大鼠弥漫性脑创伤中海马区神经元自噬对星形胶质细胞p-Cx43降解机制的研究，阐明不但海马区星形胶质细胞对神经元具有调控作用，同时神经元也对星形胶质细胞具有一定调节作用。
　　方法:将120只成年雄性SD大鼠随机分成4组:①假手术组(n=30)，②脑创伤组(n=36)③脑创伤+Saline溶剂组(n=24)④脑创伤+3-MA抑制剂组(n=30)。每组又分别划分为伤后3h、6h、24h、48h4个时间点。检测①免疫荧光双标法检测GFAP、LC3和p-Cx43的蛋白表达定位情况;②Western-blot法检测LC3和P-Cx43的蛋白表达量;③透射电镜检测神经元自噬体对缝隙连接的吞噬。分析和统计同前。
　　结果:
　　1、海马区LC3和p-Cx43的Western blot检测结果
　　Sham组LC3Ⅱ/β-actin的比值在各时间点无变化;与Sham组比较，伤后6h开始TBI组LC3Ⅱ/β-actin的比值逐渐升高，24 h达峰值，48 h仍高表达，组间差异有统计学意义(P＜0.05); TBI组与Saline溶剂组比较差异无统计学意义(P＞0.05);3-MA抑制剂组LC3Ⅱ/β-actin比值变化趋势与TBI组相似，但比值明显变小，伤后6h、24 h和48h差异均有统计学意义(P＜0.05)。p-Cx43的表达在TBI组各个时间点与Sham组比较，伤后3h开始升高，持续到伤后24 h，组间蛋白量表达有统计学意义(P＜0.05); TBI组与Saline溶剂组比较差异无统计学意义(P＞0.05);3-MA抑制剂组p-Cx43明显变大，与TBI组和Saline溶剂组比较伤后6h和24 h差异均有统计学意义(P＜0.05)。
　　2、脑创伤后海马区GFAP、LC3和p-Cx43的激光共聚焦检测结果
　　海马区星形胶质细胞标记物GFAP为DyLight488标记的绿色荧光，LC3为DyLight673标记的阳性细胞胞浆紫色荧光，p-Cx43为DyLight594标记的阳性细胞胞浆红色荧光，用DAPI行海马区细胞蓝色核染色。在sham组LC3紫色和P-Cx43红色数量少;TBI组LC3紫色和p-Cx43红色阳性强度都增加明显;3-MA抑制剂组LC3紫色阳性强度较TBI组明显减少，但p-Cx43红色阳性强度较TBI组又明显增加。LC3紫色主要定位于海马区神经元;P-Cx43红色与GFAP绿色Merge成橙色分布于海马区星形胶质细胞。
　　3、透射电镜的检测结果
　　我们使用透射电镜对脑创伤24 h后大鼠海马区神经元与星形胶质细胞缝隙连接超微结构进行观察显示:神经元细胞浆内靠近缝隙连接处可见自噬溶酶体结构。
　　小结:大鼠弥漫性脑创伤后，抑制海马区神经元自噬导致星形胶质细胞p-Cx43表达升高;透射电镜可见海马区神经元与星形胶质细胞缝隙连接旁自噬溶酶体的存在。揭示大鼠弥漫性脑创伤后海马区神经元自噬对星形胶质细胞p-Cx43的表达具有降解作用。
　　结论:
　　大鼠弥漫性脑创伤中海马区星形胶质细胞P-Cx43通过激活P2RX7和下调GLT-1表达，调控神经元自噬，抑制这条通路改善了长时程增强和大鼠的学习记忆能力，同时我们发现神经元自噬能降解星形胶质细胞p-Cx43，具有自我调控作用。

著录项

作者
孙立倩;
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作者单位

河北医科大学;

展开▼
授予单位河北医科大学;
学科外科学
授予学位博士
导师姓名崔建忠;
年度 2014
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正文语种中文
中图分类 R651.15;
关键词
创伤性脑损伤; 自噬作用; 星形胶质细胞; 分子机制;

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