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体外“心肌样”环境下GATA-4基因促进大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化

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摘要

前言

材料与方法

1 材料

2 实验方法

结果

1 骨髓间充质干细胞的形态观察和生长情况

2 心肌细胞的形态学特征

3 心肌细胞的鉴定

4 质粒提取检测结果

5 pVP22-GATA-4／myc-His质粒转染后的BMSCs

6 心肌细胞裂解液培养的BMSCs

7 GATA-4转染+心肌细胞裂解液组的BMSCs

8 免疫细胞化学染色结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述

致谢

个人简历

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摘要

目的:缺血性心脏病是当前严重危害人类健康的主要疾病之一。缺血导致心脏中具有完整舒缩功能的心肌细胞数量减少，而心肌细胞为分化终末细胞，损伤后不可再生，受损心肌细胞只能由纤维瘢痕组织修复，未受损心肌细胞肥大以部分代偿失去的心功能，终将发展为充血性心力衰竭。因此，增加具有完整舒缩功能的心肌细胞数量是治疗心肌受损的关键。目前的治疗方法主要包括药物治疗、介入治疗和手术等，虽然在一定程度上延缓了病程的发展，但却不能逆转已坏死的心肌，临床效果有限。干细胞移植治疗冠心病是一个新兴的治疗思路，虽然目前还处于基础和临床研究阶段，但为缺血性心肌病患者带来了新的希望[1]。研究表明干细胞移植能促进心脏血管和心肌细胞的新生，改善心肌血液供应，增强心脏功能。
　　 在细胞移植的众多研究中，骨髓间充质干细胞移植因有更广泛的临床应用前景更是受到科学家的青睐[2]。骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs)，是主要存在于骨髓中，是一类具有多向分化潜能的非造血干细胞。在某些诱导条件下，这些细胞可以定向分化为多种组织，特别是中胚层以及外胚层来源的组织细胞，例如骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、肌细胞等。基础和临床研究均证实，骨髓间充质干细胞移植可修复受损的心肌，显著改善心肌梗死后心功能[3]。骨髓间充质干细胞作为供体细胞有很多理想的特性，如取材方便，对机体损伤小，并具有高增殖和良好的分化潜能，而且易于导入外源基因，在缺血组织内仍然能够成活，自体细胞移植无免疫排斥反应等。这些优点使骨髓间充质干细胞成为心脏干细胞移植主要的干细胞种类之一。
　　 GATA-4（GATAbindingfactor-4）属GATA转录因子基因家族，是一组组织特异性表达的转录因子，该家族转录因子具有特定DNA结合的锌指结构域，在进化过程中高度保守。GATA-4在中胚层和内胚层起源的组织中广泛表达，但它对于心脏发育却是必需的，是心脏前体细胞的最早期标志之一。GATA-4因子首先在心前期中胚层中表达，随后在心内膜和心肌中表达。GATA-4的缺失或突变会引起心肌发育不全和心内膜垫缺损。另外，GATA-4可以抑制心肌细胞凋亡，调节成人心脏存活[4]。近年有研究证实，GATA-4在心肌梗死修复中，也扮演着重要的调节作用，它可以促进血管生成，增加心肌细胞存活和分化[5]。
　　 本实验利用脂质体转染法将GATA-4基因瞬时转染到SD大鼠骨髓间充质干细胞中，观察其在心肌细胞裂解液模拟的心肌微环境中向心肌细胞的分化，并与单纯的微环境诱导的骨髓间充质干细胞对比，以试图阐明心肌细胞分化中的一些规律，为今后有效地诱导心肌细胞提供策略。
　　 方法:
　　 1.SD大鼠骨髓间充质干细胞的分离、纯化和扩增
　　 利用贴壁培养法体外培养骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs)，BMSCs培养于含15％胎牛血清的DMEM/F12培养基中，48h首次换液，以后3～4天换液1次，当细胞铺满培养瓶瓶底80％～90％时传代。取第三代细胞做后续试验。
　　 2.SD大鼠乳鼠心肌细胞的分离、培养及心肌细胞裂解液的制备
　　 通过多次消化法从生后1～3天的SD大鼠心脏中分离心肌细胞，用差时贴壁法去除成纤维细胞，并用0.1mmol/LBrdu抑制成纤维细胞生长，心肌细胞培养于含15％胎牛血清的DMEM/F12培养基中。取生长一周，状态良好的心肌细胞，通过反复冻融法制成心肌细胞裂解液。
　　 3.质粒pVP22-GATA-4/myc-His转染BMSCs
　　 利用转染试剂Lipofectamine2000将含有GATA-4的质粒转染到BMSCs中，于转染后48小时通过免疫细胞化学染色的方法检测GATA-4在细胞中的表达，以确定转染效率。
　　 4.实验分组
　　 本实验分为对照组和实验组。对照组的BMSCs在含有心肌细胞裂解液DMEM/F12培养基中培养，实验组BMSCs转染pVP22-GATA-4/myc-His质粒48h后用含有心肌细胞裂解液DMEM/F12培养基培养。各组在诱导10、20、30天以免疫细胞化学染色方法检测心肌钙蛋白(cTnT)在BMSCs中的表达。
　　 结果:
　　 1.BMSCs接种24h后可见部分细胞贴壁，以体积大的圆形细胞为主。48h后，贴壁细胞呈纺锤状的成纤维细胞外观。原代培养3天，细胞开始呈集落样生长，增殖明显，呈现多种形态，主要为成纤维细胞样，呈梭形或星形，体积较小，随着继续培养，细胞体积增大。7～10d后，细胞呈梭形，集落明显增大并融合，可铺满瓶底。传代后细胞呈圆形，散在分布，24h贴壁，细胞体较原代增大，逐渐重新变为梭形。刚经传代的大鼠骨髓间充质干细胞呈圆形，24小时内完全贴壁、伸展并重新变成长梭形细胞。传代培养3天后，可见细胞体积较原代细胞明显增大，多呈扁平状、多角形，细胞基本铺满瓶底，细胞间隙变小，细胞排列呈一定方向性。第2代BMSCs形态开始呈比较均一的成纤维样形态，细胞排列呈“网状”或“漩涡状”。
　　 2.消化得到的乳鼠心肌细胞呈球形，大小相似，漂浮于培养液中，培养12h后开始贴壁生长，并逐渐伸出突起。24h大部分贴壁细胞周边有短的足状突起，单个细胞自行蠕动，频率较慢，48h贴壁率高达80％，细胞呈多边形、星形，体积较大，伸出的伪足相互接触交织成网，细胞搏动有力，收缩明显，80～120次/min。7d左右形成细胞簇，铺满瓶底，细胞簇搏动呈明显同步性。免疫细胞化学染色(cTnT)计数得到心肌细胞的纯度达80％，满足实验要求。
　　 3.所提质粒用微量核酸检测仪测定A260/280的比值在1.85左右，浓度在600～1000ug/mL，浓度和纯度均符合转染的要求。
　　 4.细胞诱导培养10天、20天和30天后，实验组与对照组用免疫细胞化学染色均能检测到有cTnT（细胞质阳性表达）蛋白的表达，经统计学分析，可见表达有逐渐增高的趋势，且有显著差异。实验组和对照组相比，在10天、20天和30天三个时间点，实验组cTnT表达量均高于对照组，经统计学分析，两者相比有显著差异。
　　 结论:
　　 1.BMSCs在心肌细胞裂解液模拟的心肌微环境中可向心肌细胞分化在蛋白水平表达心肌标志物，且表达量随培养天数增加而逐渐增高。
　　 2.在心肌细胞裂解液模拟的心肌微环境中，转染GATA-4基因的BMSCs向心肌细胞的分化的情况优于未转染的BMSCs，说明转录因子GATA-4可以促进BMSCs向心肌分化。

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