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单纯胰岛素抵抗及糖尿病大鼠肝脂肪酸代谢相关基因表达变化

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综述 PPAR家族及其在代谢综合征中作用

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摘要

目的：胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）是导致2型糖尿病、动脉粥样硬化等疾病的危险因素，是2型糖尿病的基本特征。胰岛素抵抗和2型糖尿病状态下，血中游离脂肪酸（free fatty acid，FFA）增加，肝脏中的游离脂肪酸和甘油三酯也增加。肝脏的脂肪酸有以下代谢途径：一是进入线粒体进行β-氧化。肉碱脂酰转移酶Ⅰ（camitine palmitoyltransferaseⅠ，CPTⅠ）是线粒体氧化长链脂肪酸的关键酶。二是进入过氧化物酶体进行β-氧化。软脂酸辅酶A氧化酶（palmitoyl-CoA oxidase，ACOX1）主要参与直链极长链脂肪酸氧化；降植烷酰辅酶A氧化酶（pristanoyl-CoA oxidase，ACOX3）主要参与支链脂肪酸的氧化。酯酰辅酶A氧化酶2（acyl-CoA oxidase2，ACOX2）催化三羟及二羟胆甾烷酰基辅酶A侧链的氧化脱氢，参与胆汁酸的合成。三是再酯化合成甘油三酯。二酰基甘油酰基转移酶（diacylglycerol transferase，DGATs）催化甘油三酯合成体系中最后一步，是甘油三酯合成的关键酶，它有两个亚型：DGAT1和DGAT2。上述途径共同维持肝脂肪酸代谢的动态平衡。
　　 糖尿病状态下，由于胰岛素作用缺陷引起葡萄糖利用障碍，使组织更多地依赖脂质氧化供给能量。研究发现，糖尿病和单纯胰岛素抵抗大鼠肝不仅线粒体脂肪酸β-氧化活性增强，而且过氧化物酶体脂肪酸β-氧化活性增强。在大剂量STZ所致糖尿病大鼠，过氧化物酶体脂肪酸β-氧化活性增强与ACOX1的mRNA表达增加有关。那么在2型糖尿病和单纯胰岛素抵抗状态下，线粒体和过氧化物酶体脂肪酸β-氧化活性的增强与β-氧化途径中哪些酶基因表达增加有关呢?
　　 过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα），是核受体转录因子，被配体激活后，通过调控线粒体和过氧化物酶体β-氧化途径中的CPIⅠ、ACOX1、LBP等下游基因的转录，增加脂肪酸的分解代谢。研究发现，大剂量STZ所致糖尿病大鼠肝组织PPARα表达是增加的，那么2型糖尿病和单纯胰岛素抵抗状态下PPARα表达如何呢?
　　 胰岛素抵抗和2型糖尿病状态下肝脏常伴有甘油三酯沉积，我室以前的研究也在胰岛素抵抗和2型糖尿病大鼠肝中发现此种现象。肝甘油三酯沉积是否与DGAT酶基因表达增加有关?
　　 基于上述目的，本实验以SD大鼠为对象，采用高脂饮食复制胰岛素抵抗模型，再复加腹腔注射小剂量STZ，复制2型糖尿病模型。在此基础上，观察肝组织脂肪酸代谢调节因子PPARα基因，线粒体和过氧化物酶体脂肪酸β氧化相关酶CPTⅠ、ACOX1、ACOX2、ACOX3、LBP、DBP、THLA、THLB、SCPx基因，以及甘油三酯合成限速酶DGAT1和DGAT2基因的表达情况，从而探讨胰岛素抵抗和2型糖尿病状态下肝脏脂质代谢紊乱的分子机制。
　　 方法：
　　 1实验动物分组及标本处理
　　 根据本试验室王晓凌等的造模方法，以成年雄性SD大鼠（体重220-240g）为实验对象，用高脂饮食（脂类以猪油为主，热量比占59.8％）复制胰岛素抵抗模型（insulin resistance group，IR）；在胰岛素抵抗的基础上，一次性注射小剂量STZ复制2型糖尿病大鼠模型（diabetic mellitus group，DM）。血清，用于血糖、血总游离脂肪酸测定；肝脏组织，用于肝组织油红染色，肝总游离脂肪酸，甘油三酯含量测定，及总RNA提取。
　　 2血糖测定
　　 用HITACHI7170A型全自动生化分析仪，氧化酶法测定血糖。以mmol/L表示。
　　 3血清及肝组织总游离脂肪酸的测定
　　 用南京建成总脂肪酸测定试剂盒，铜显色法测定血清和肝组织总游离脂肪酸的含量。分别用mmol/L和μmol/gprot表示。
　　 4肝组织甘油三酯含量的测定
　　 用氧化酶法测定肝甘油三酯含量，结果用每克肝组织所含甘油三酯微摩尔数表示（μmol/g组织）。
　　 5肝组织有关基因mRNA表达的测定
　　 用Promega总RNA提取试剂盒提取肝组织总RNA。用NanoDrop ND-1000紫外/可见光光度计进行RNA定量。以18S rRNA做内参，real-time PCR测定PPARα、CPTⅠ、ACOX1、ACOX2、ACOX3、LBP、DBP、THLA、THLB、SCPx、DGAT1和DGAT2 mRNA的相对表达量。
　　 6数据处理
　　 所有数据均用x±s表示，采用SPSS13.0软件进行统计学分析，对所测定结果进行正态性及方差齐性检验，做两个独立样本t检验（双尾），检验以P<0.05为差异有统计学意义。
　　 结果：
　　 1造模
　　 1.1 OGTT试验验证胰岛素抵抗
　　 我室王晓凌等已经通过OGTT、ISI和血糖钳试验证实，此种造模方法，大鼠于高脂喂养8周时产生明显胰岛素抵抗，因此，在我们的试验中，只用OGTT试验验证胰岛素抵抗的产生。
　　 高脂喂养组的糖耐量曲线下面积（AUC）平均值为31.138±1.797mmol/L*h，高于对照组27.822±1.271mmol/L*h，差异有统计学意义（P<0.01）。（AUC=0.5×空腹血糖+30 min血糖+1.5×60 min血糖+120 min血糖）表明，胰岛素抵抗模型成立。
　　 2空腹血糖变化
　　 空腹血糖对照组为4.966±0.433mmol/L，单纯胰岛素抵抗组为5.511±0.345mmol/L，糖尿病组为12.717±1.862mmol/L。单纯胰岛素抵抗组与对照组相比空腹血糖增加，差异有统计学意义（P<0.01）；糖尿病组和对照组相比，空腹血糖增加，差异有统计学意义（P<0.01）。表明，糖尿病模型成立。
　　 3血清总游离脂肪酸的变化
　　 对照组为0.581±0.114mmol/L，单纯胰岛素抵抗组为1.602±0.112mmol/L，糖尿病组为1.558±0.084mmol/L。与对照组相比，单纯胰岛素抵抗组和糖尿病组血清总游离脂肪酸均增加，差异有统计学意义（P<0.01）。表明，单纯胰岛素抵抗和糖尿病状态下，机体脂代谢异常。
　　 4肝组织总游离脂肪酸的变化
　　 对照组为81.365±10.609μmol/gprot，单纯胰岛素抵抗组为213.922±40.809μmol/gprot，糖尿病组为156.080±19.268μmol/gprot。与对照组相比，单纯胰岛素抵抗组和糖尿病组肝组织总游离脂肪酸均增加，差异有统计学意义（P<0.01）。
　　 5肝组织油红染色
　　 油红染色显示，Con组仅发现极少量脂滴存在；HF组和DM组出现大量弥漫性脂肪滴，表明胰岛素抵抗和糖尿病组大鼠肝组织脂肪沉积。
　　 6肝组织甘油三酯含量的变化
　　 对照组肝组织脂肪含量为11.30±1.89μmol/g组织，单纯胰岛素抵抗组为34.94±4.93μmol/g组织，糖尿病组为51.47±7.77μmol/g组织。与对照组相比，单纯胰岛素抵抗组和糖尿病组肝组织甘油三酯含量均增加，差异有统计学意义（P<0.01）。
　　 结果4-6表明，单纯胰岛素抵抗和糖尿病状态下，肝组织脂代谢异常。
　　 7待测基因mRNA相对表达量的变化
　　 对照组为0.099±0.018，单纯胰岛素抵抗组为0.072±0.015，糖尿病组为0.098±0.016。ACOX2相对表达量，与对照组相比，单纯胰岛素抵抗组表达降低，有统计学差异（P<0.01），糖尿病组变化无统计学差异（P>0.05）。表明胰岛素抵抗状态下很可能胆汁酸的合成是降低的。
　　 结论：
　　 1胰岛素抵抗状态下，肝过氧化物酶体脂肪酸β-氧化的增加与ACOX1、LBP、THLA/B、ACOX3、DBP、SCPx基因的表达增加有关；肝线粒体脂肪酸β-氧化的增加与CPTⅠ基因的表达无关。
　　 2糖尿病状态下，肝过氧化物酶体脂肪酸β-氧化增加与ACOX1、LBP、DBP、THLA/B基因表达增加有关；肝线粒体脂肪酸β-氧化增加与CPTⅠ基因的表达无关。
　　 3胰岛素抵抗及糖尿病状态下，肝组织甘油三酯沉积与DGAT1和DGAT2基因的表达增加有关。

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