JNK1与TIPE2在感染后膈肌无力发生中调控机制的研究

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背景：在人体与呼吸有关的呼吸肌中，膈肌（ diaphragm）是最重要的，呼吸肌功能的60％~80%都是由膈肌完成的，所以膈肌对于维持生物体的呼吸功能具有不可替代的作用。研究发现，机体在受到病毒、细菌等引起的感染时会引起膈肌收缩功能障碍，出现无力现象，但是对于该现象的机制一直没有研究清楚。临床上造成感染的可能原因比较广泛复杂，比如胸腹部感染，败血症和感染性休克等，我们课题组一直从事于膈肌无力机制的研究，对于LPS诱导的内毒素血症型大鼠中膈肌功能障碍研究具有一定前期基础，对于其相关发生机制的研究是本实验的主要目的。根据本组之前研究的结果，发现JNK1通路在膈肌无力的发病过程中具有明显作用，据此本实验利用LPS（Lipopolysaccharide）作用于大鼠造成感染，构建大鼠膈肌肌无力模型，研究LPS诱导的内毒素血症大鼠中可能导致膈肌功能障碍的有关蛋白的表达及其变化情况，同时腹腔注射SP600125（JNK1抑制剂），观测JNK1通路被抑制之后，大鼠膈肌的有关功能是否得到保护，大鼠膈肌的收缩功能是否得到某种程度上的恢复。TIPE2作为免疫负调控因子在炎症的过程中起到非常重要的作用，本实验同时对TIPE2等基因做了检测，以期阐明JNK1通路中有关蛋白的表达情况以及TIPE2基因在膈肌无力中起到的作用。
　　目的：构建内毒素血症大鼠膈肌无力模型，研究JNK1通路有关蛋白以及TIPE2基因在膈肌无力中的作用，同时构建小鼠骨骼肌细胞C2C12细胞LPS感染模型，进一步研究JNK1通路的有关调控机制。
　　方法：雄性SD大鼠40只，精神状态良好，体重180~220g，用随机分组的方法分为对照组、LPS模型组以及LPS+SP600125（JNK1抑制剂）组。给药方法：对照组的10只大鼠给予腹腔注射生理盐水；LPS组15只，腹腔(i.p)注射LPS（12mg/kg）；LPS+SP600125组15只，腹腔(i.p)注射LPS的同时给予腹腔注射SP600125（30μM/kg）所有分组处理24h后处死；另外，每组皮下注射30ml/kg的生理盐水。24h后将大鼠进行麻醉行气管插管，记录呼吸功能有关参数、对动脉血气进行分析并且将大鼠膈肌离体分离制备膈肌肌条分别测定单收缩张力（Pt）同时测定最大强直张力（Po）、进而用MedLab信号采集系统收集峰值收缩时间(CT)、半舒张时间(1/2RT)、张力最大上升速率(+dT/dtmax）、张力最大下降速率(-dT/dtmax)、张力-频率曲线(Force-frequency curve)及疲劳指数(FI)的变化，同时收集膈肌标本用于Western Bolt、RT-PCR等实验测定有关基因及蛋白的表达情况，并用 HE染色和免疫组化的方法观察膈肌组织的形态变化。构建 JNK1、TIPE2过表达和沉默质粒，将质粒转染至小鼠骨骼肌细胞C2C12感染模型中利用Western Blot、RT-PCR以进一步探讨JNK1通路、TIPE2基因在膈肌无力中的作用机制。
　　结果：⑴与对照组相比，LPS组大鼠无论在潮气量还是肺通气量及最大肺通气量均明显降低(P<0.01)。LPS+SP600125组与LPS组比较各值均明显提高(P<0.01)。⑵与对照组相比，LPS组大鼠膈肌Pt、Po、+dT/dtmax、-dT/dtmax明显降低，CT、1/2RT明显增高（P<0.01）。LPS+SP600125组与LPS组比较，大鼠膈肌的Pt、Po、+dT/dtmax、-dT/dtmax显著提高（P<0.01），CT、1/2RT明显降低（P<0.01）；LPS+SP600125组与对照组比较，Pt、Po、CT、1/2RT、+dT/dtmax、-dT/dtmax差异无统计学意义（P>0.05）。⑶Western Blot显示LPS组TIPE2、p-JNK的表达量明显升高，而JNK1无明显变化，LPS+SP600125组JNK1得到抑制之后，JNK1的激活体表达降低，TIPE2的表达表达亦呈现明显的下降趋势，RT-PCR得到一致结果。⑷利用HE染色方法显示，对照组大鼠的膈肌肌纤维形状较为规则，排列相对整齐，相比而言LPS组大鼠的膈肌肌纤维则呈现出走向紊乱状况，甚至断裂溶解，间质水肿。⑸免疫组化结果显示TIPE2在LPS组的表达明显高于Control组，颜色较深，差异具有统计学意义（P<0.05），JNK1的检测结果显示无明显变化。⑹不同时间点的C2C12肌细胞感染模型显示，p-JNK、TIPE2随着LPS刺激时间的增加表达增多，24h之后表达会下降。之后又构建JNK1、TIPE2过表达载体转染至C2C12细胞，利用RT-PCR方法检测发现，两者的表达趋势呈正相关性，这与动物模型实验结果一致。
　　结论：①内毒素血症大鼠出现膈肌无力表现，注射 SP600125之后膈肌功能得到改善，SP60125可能对膈肌具有一定的保护作用。②LPS刺激大鼠之后可以激活JNK1通路，p-JNK、TIPE2表达升高；JNK1被抑制之后，p-JNK、TIPE2表达下降，膈肌收缩能力恢复，提示大鼠膈肌收缩能力的变化可能与JNK1通路的调控有关。③JNK1与TIPE2存在正向调控关系。

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作者
曹承华;
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作者单位

河南大学;

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授予单位河南大学;
学科生物学、微生物学
授予学位硕士
导师姓名姬新颖,程相树;
年度 2015
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类其他;
关键词
膈肌无力; 细菌感染; 蛋白表发; 细胞病理学;

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