猪流行性腹泻抗原基因COE的原核表达与纯化

声明

致谢

摘要

1 文献综述

1．1 简介

1．1．1 猪流行性腹泻病简介

1．1．2 临床症状

1．1．3 发病原因

1．1．4 病理变化

1．1．5 诊断方法

1．2 PEDV的基因组结构与复制

1．2．1 PEDV基因组结构

1．2．2 PEDV基因组复制

1．3 PEDV基因组编码的蛋白及其功能

1．3．1 非结构蛋白及其功能

1．3．2 结构蛋白及其功能

1．4 PEDV表面抗原蛋白表达与纯化方面的研究

1．5 PEDV疫苗的研究进展和发展前景

1．5．1 传统疫苗

1．5．2 基因工程疫苗

1．5．3 联苗

1．5．4 发展前景

1．6 本实验研究的目的与意义

2 引言

3 材料

3．1 仪器设备

3．2 病料、菌种、质粒

3．3 主要试剂

3．4 部分试剂与培养基的配置

4 方法

4．1 引物的设计

4．2 病毒RNA的提取

4．3 RT-PCR

4．4 PCR产物回收

4．5 连接

4．6 连接产物的转化

4．6．1 JM109感受态细胞的制备

4．6．2 转化

4．6．3 PMD19-T-COE连接载体的鉴定

4．7 表达载体的构建

4．7．1 分别对质粒PMD19-T-COE和原核表达载体PET-32a进行双酶切

4．7．2 重组质粒PET-32a-COE转化到BL21(DE3)pLysS细胞及鉴定

4．8 HIS-COE蛋白的表达及鉴定

4．8．1 诱导表达

4．8．2 SDS-PAGE

4．8．3 蛋白质表达条件的优化

4．9 包涵体的纯化与复性

4．9．1 样品的制备

4．9．2 样品预处理

4．9．3 柱子的制备

4．9．4 透析袋的处理

4．9．5 过柱纯化

4．9．6 复性

4．9．7 western blot

5 结果与分析

5．1 COE基因扩增

5．2 重组质粒PMD19-T-COE的鉴定与分析

5．2．1 菌液PCR鉴定

5．2．2 重组质粒PMD19-T-COE的双酶切鉴定

5．2．3 重组质粒PMD19-T-COE的鉴定结果分析

5．3 COE基因测序结果与分析

5．3．1 COE基因测序结果

5．3．2 PEDV-COE基因测序比对结果分析

5．4 重组质粒PET-32a-COE的鉴定与分析

5．4．1 菌液PCR鉴定

5．4．2 双酶切鉴定重组质粒PET-32a-COE

5．4．3 重组质粒PET-32a-COE的鉴定结果分析

5．5 SDS-PAGE鉴定结果与分析

5．5．1 重组菌BL21(DE3)pLysS／PET-32a-COE的SDS-PAGE

5．5．2 重组蛋白HIS-COE诱导条件的优化

5．5．3 重组蛋白HIS-COE可溶性分析

5．5．4 HIS-COE蛋白的纯化

5．5．5 SDS-PAGE鉴定结果分析

5．6 HIS-COE蛋白western blot结果与分析

5．6．1 HIS-COE蛋白western blot结果

5．6．2 HIS-COE蛋白western blot结果的分析

6 结论与讨论

参考文献