六种经济鱼类生长激素基因cDNA的克隆和原核表达

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根据鲤形目和鲇形目生长激素(Growthhormone，GH)基因N-末端和C-末端碱基序列的保守性设计一对简并引物；从脑垂体中提取总RNA，用RT-PCR方法扩增并克隆到了大鳞副泥鳅(Paramisgurnusdabryanus)、泥鳅(Misgurnusanguillicaudatus)、胭脂鱼(Myxocyprinusasiaticus)、鲇鱼(Silurusasotus)、黄河鲤(CyprinuscarpioinHuangheriver)和淇河鲫(CarassiusauratusinQiheriver)6种重要经济鱼类的GH基因cDNA，并详细分析了其序列特征。序列同源性检索表明，所克隆的cDNA片段为这6种鱼的GH基因，其GenBank注册号分别为DQ350432、DQ350433、DQ350434、DQ350435、DQ350436和DQ350437。其中大鳞副泥鳅和胭脂鱼的GH基因序列系第一次克隆。分析其核苷酸序列和推测的氨基酸序列，结果显示：本研究克隆到的鲇鱼生长激素基因的开放阅读框(ORF)包括603个核苷酸，编码200个氨基酸，其中包括22个氨基酸的信号肽和178个氨基酸的成熟肽；其它五种鱼的ORF均为633bp，编码210个氨基酸，其中包括22个氨基酸的信号肽和188个氨基酸的成熟肽；泥鳅和大鳞副泥鳅成熟肽氨基酸序列的同源性为100％。这6个蛋白成熟肽序列和其它已知的鱼类GH都有较高的同源性，特别是与相同目的鱼类序列相比，但与高等脊椎动物GH的同源性较低。通过比对，在这些蛋白序列内鉴定了许多保守的氨基酸残基，其中的大多数聚集而成5个保守域。基于这6种鱼类与其它鱼类和高等脊椎动物的GH成熟肽氨基酸序列进行分子系统学分析，结果(MP树和NJ树)与根据形态特征重建的系统发育树基本一致。用6种鱼的特异引物(上游引物加入NdeⅠ酶切位点，下游引物加入XhoⅠ酶切位点)分别扩增了大鳞副泥鳅、鲇鱼、胭脂鱼、黄河鲤和淇河鲫的GH成熟肽，将其定向插入到融合表达载体pET-28a质粒中，转化大肠杆菌BL21(DE3)，用质粒PCR方法筛选阳性克隆，用NdeⅠ和XhoⅠ酶切鉴定重组质粒。以IPTG诱导融合蛋白表达，SDS-PAGE分析表明诱导重组质粒表达了融合蛋白，主要为不溶性的包含体，鲇鱼分子量约为22.5kD,其它4种约为23.5kD，与实验预期的分子量一致。5种融合蛋白表达量均超过蛋白总量的50％。融合蛋白N-末端带有组氨酸标签，采用固定化金属配体亲和层析，获得电泳纯的重组蛋白。本研究克隆到了6种鱼的GH基因cDNA序列，并成功构建了原核表达载体，实现了5种重组GH蛋白的高效表达，为进一步开展其应用和生物活性检测分析及研制新型鱼类生长促进剂奠定了基础。

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作者
陈丽丽;
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作者单位

河南师范大学;

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授予单位河南师范大学;
学科水产养殖
授予学位硕士
导师姓名常重杰;
年度 2006
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类人工繁殖;配合饲料;转化及克隆;
关键词
经济鱼类; 淇河鲫; 生长激素; cDNA序列; 原核表达; 生长促进剂;

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