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【6h】

UPLC-MS/MS检测人体生物样本Etheno-DNA加合物的方法研究

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DNA作为细胞生命活动最重要的遗传物质,保持其分子结构的稳定性和完整性对于细胞活性和生理功能的正常发挥具有重要意义。DNA氧化损伤主要是活性氧自由基及其代谢产物攻击DNA,并与DNA碱基结合形成加合物引起的。DNA是内源性及外源性如辐射和化学氧化剂诱导引起的活性氧自由基进攻细胞的主要目标,DNA加合物可以作为生物标志物来反映化学致癌物到达靶位的内接触剂量,也可以作为一种效应标志物,反映DNA受到化学致癌物损伤的效应剂量。因此,建立高灵敏度、高特异性的DNA加合物检测方法是毒理学研究的热点之一。
　　 本文利用超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱,建立了人群生物样本(血、尿)中1,N6-ethcno-2-deoxyadcnosine(εdA)和3,N4-etheno-2'-dcoxycytidine(εdC)加合物的检测方法,该方法利用同位素标记的[15N5]εdA和[15N3]εdC作为内标,具有高灵敏度、高特异性和高通量的特点,适用于大量样本的人群生物监测和分子流行病学研究。研究内容主要包括以下三个方面:
　　 1.标准品的合成、纯化和定量:包括合成3,N4-etheno-2'-deoxycytidine(εdC)加合物作为外标,稳定同位素标记的[15N5]1,N6-etheno-2'-deoxyadcnosine和[15N3]3,N44-ethcno-2'-deoxycytidine加合物作为内标。采用RP-HPLC进行纯化、脱盐,对纯化后的标准品进行定量。合成的标准品作为内标和外标用于计算生物样本中εdA和εdC加合物的量,校正生物样本前处理过程εdA和εdC加合物的回收率。
　　 2.生物样本(血、尿)的前处理方法的建立和优化:DNA加合物在人体生物样本中含量很低(通常108个碱基中0.1-1个加合物)。建立高特异性、高灵敏度的DNA加合物的检测方法,关键在于生物样本前处理方法的优化。本研究采用micrococcal endonuclcase,spleen phosphodiesterase,nuclease P1酶解结合RP-HPLC的方法。富集和纯化血中εdA和εdC加合物;采用固相萃取富集和纯化尿中的εdA和εdC加合物。该方法具有简便易行、回收率高的特点,尿中εdA和εdC回收率分别为:89.6±6.52％和88.9±7.7%;血中εdA和εdC回收率分别为:83.7±7.1%和83.3±2.9%。
　　 3.建立和优化UPLC-MS/MS的条件,检测生物样本中etheno-DNA加合物:采用ESI正离子模式和多反应监测(MRM)方法,建立了检测人体生物样本中etheno-DNA加合物的方法。该方法具有高灵敏度、高特异性和高通量的特点,尿液中εdA和εdC检测限为:0.51fmol/ml和0.63fmol/ml:血液中εdA和εdC检测限为:0.65fmol/ml和0.83fmol/ml

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