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NO介导白桦三萜合成的蛋白质巯基亚硝基化初步研究

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摘要

1 绪论

1．1 白桦三萜的研究进展

1．2 硫化氢(H2S)的研究进展

1．3 NO与蛋白质翻译后修饰的研究进展

1．4 亚硝基化谷胱甘肽还原酶(GSNOR)在植物中的研究进展

1．5 转录组测序研究进展

1．6 本研究的目的及意义

2．1 材料的获得与培养

2．1．1 白桦组培苗及白桦悬浮细胞的获得与培养

2．3 H2S含量的测定

2．4 半胱氨酸脱巯基酶活性的测定

2．6 NOS酶活性的测定

2．7 NR酶活性的测定

2．7．1 标准曲线的制作

2．7．2 NR酶活性的测定

2．8 白桦酯醇的提取与测定

2．8．1 标准曲线的制作

2．8．2 测试样品的制备

2．9 转录组测序

2．9．1 植物材料

2．9．2 转录组测序流程

2．9．3 转录组数据分析流程

2．10 实时荧光定量PCR检测

2．10．1 总RNA的提取

2．10．2 实时荧光定量PCR检测

3 结果与分析

3．1．1 外源H2S对白桦悬浮细胞干重与三萜累积的影响

3．1．2 外源H2S对白桦悬浮细胞中内源H2S与NO含量的影响

3．1．3 内源NO/H2S介导H2S／NO对白桦酯醇积累的影响

3．1．4 讨论

3．2 白桦GSNOR转基因植株差异表达基因分析

3．2．1 转录组数据的质量监控

3．2．2 白桦Unigene基本注释

3．2．3 差异表达基因概况

3．2．4 讨论

3．3．1 GSNOR与Unigene相关性分析

3．3．2 GSNOR与三萜合成相关性分析

3．3．3 差异表达基因的相关性分析

3．3．4 白桦转录因子家族分析

3．4 差异表达基因分析

3．4．1 差异倍数大于10的Unigene分析

3．4．2 谷胱甘肽代谢相关基因的差异表达

3．4．3 硫代谢相关基因的差异表达

3．4．4 氮代谢相关基因的差异表达

3．4．5 差异表达基因的验证

3．4．6 讨论

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

声明

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摘要

NO是介导植物细胞次生代谢物合成的一种必需信号分子，蛋白质巯基亚硝基化是NO介导的蛋白翻译后修饰之一，也是NO发挥其信号转导作用的重要途径。NO介导的蛋白巯基亚硝基化是否参与了白桦三萜的积累还未见报道。为此，本研究一方面以白桦悬浮细胞为材料，研究NO与H2S互作对白桦三萜积累的影响;另一方面，通过白桦GSNOR基因沉默转基因植株的转录组分析进一步揭示NO介导的蛋白质巯基亚硝基化对白桦三萜代谢的影响。主要结果如下:
　　1.内源NO/H2S介导H2S/NO促进三萜积累的研究
　　将H2S供体NaHS及其抑制剂羟胺(NH2OH)、NO供体硝普钠(SNP)及一氧化氮合酶抑制剂(L-NAME)分别添加到培养8d的白桦悬浮培养体系中处理2d，分析H2S含量，H2S合成关键酶活性，NO含量，NO合成关键酶活性及白桦酯醇含量的变化。研究发现，外源H2S促进内源NO与白桦酯醇的积累，其中NO含量比对照增加了60.84％,白桦酯醇含量比对照增加了71.03％;外源NO同样促进了内源H2S与白桦酯醇的积累，H2S含量比对照增加了28.23％，白桦酯醇含量比对照增加了234.41％;SNP与NH2OH处理相比于SNP单独处理下H2S和白桦酯醇含量下降，NaHS与L-NAME处理相比于NaHS单独处理下NO与白桦酯醇无显著差异。由此推断，内源NO与H2S互作参与了白桦三萜的合成。
　　2.白桦GSNOR基因沉默转基因植株差异表达基因
　　以白桦野生型组培苗与GSNOR沉默转基因植株为实验材料，利用Illumina高通量测序技术，进行了转录组测序和De novo组装，并对得到的Unigene进行了功能注释、分类及代谢通路分析，结果表明:得到N50值为1，753bp、平均长度为950bp的白桦Unigene共61，136条。将其与Nr、KEGG、Swiss-Prot和COG/KOG数据库比对后发现有31，803个Unigene获得注释。白桦GSNOR转基因植株中差异表达的基因共有7038个，表达量上调基因为3,464个，表达量下调基因为3，574个。
　　选取与白桦GSNOR基因相关性达到0.99以上的Unigene进行分析，结果表明，与GSNOR呈现显著负相关的基因少于呈现显著正相关的基因，且多来自于转录因子家族，包括NAC，bZIP，MYB，bHLH，ABC，而与GSNOR呈现显著正相关的基因多来自于核酸代谢与氨基酸代谢，除此之外还与多种含氮化合物的代谢呈显著正相关，包括硝酸还原酶与苯丙酸。根据GSNOR与三萜合成相关Unigene的相关性分析，环阿齐醇合成酶与GSNOR相关性为0.8，而β-香树脂醇合成酶与GSNOR相关性为0.5。
　　3.NO介导的蛋白亚硝基化对白桦三萜积累的影响
　　进一步对差异倍数大于10的510个Unigene进行分析，其中下调的Unigene有472个，主要多分布于抗病蛋白中;上调的Unigene有38个，主要多分布于细胞色素P450家族与三萜合成途径中。通过实时荧光定量PCR证实三萜合成关键酶基因FPPS、LUS、CAS2、VIT表达趋势与转录组测序相同，均为上升趋势，并且通过比色法测定的三萜总含量趋势也与转录组表达水平一致。由此推断，NO介导的蛋白亚硝基化参与了白桦三萜的累积。

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