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拟南芥核糖核酸酶YbeY参与叶绿体rRNA加工的功能研究

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摘要

1 绪论

1．1 光合作用

1．1．1 光合作用概述

1．1．2 光系统组成

1．2 叶绿体的起源、结构和生物合成

1．2．1 叶绿体的起源和结构

1．2．2 核基因和质体基因共同控制叶绿体发育

1．3 叶绿体核糖体的结构和生物合成

1．3．1 叶绿体核糖体的结构

1．3．2 叶绿体核糖体的成熟和组装

1．3．3 多因子参与的叶绿体核糖体rRNAs的加工

1．4 核糖核酸酶与叶绿体rRNA成熟

1．5 细菌YbeY的研究进展

1．6 本研究的目的意义

2 实验材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 细菌材料

2．1．3 植物培养材料和条件

2．1．4 克隆载体和表达载体

2．1．5 实验所需要的酶和基本试剂

2．1．6 实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 数据库搜索和序列分析

2．2．2 拟南芥培养和遗传转化

2．2．3 核酸操作方法

2．2．4 蛋白操作方法

2．2．5 叶绿体超微结构的检测

2．2．6 生理生化指标的检测

2．2．7 原生质体制备和GFP荧光蛋白检测

3 实验结果和分析

3．1 植物YbeY的识别及序列信息

3．1．1 YbeY的植物同源基因识别

3．1．2 植物YbeY结构域分析

3．1．3 植物YbeY的进化树

3．1．4 植物YbeY序列分析

3．2 拟南芥YbeY基因及其表达

3．2．1 拟南芥YbeY序列分析

3．2．2 AtYbeY的组织转录表达分析

3．2．3 AtYbeY基因转录表达对光和热的响应

3．2．4 AtYbeY蛋白的亚细胞定位

3．3 AtYbeY基因突变体及其遗传表型

3．3．1 T-DNA突变体的鉴定和其表型分析

3．3．2 AtYbeY-amiRNA突变体的获得和其表型

3．3．3 AtYbeY回补突变体材料获得和其表型

3．4 atybeY突变体的光合生理特性

3．4．1 atybeY突变体的叶绿素含量

3．4．2 atybeY突变体的叶绿素荧光特征

3．5 atybeY突变体的叶绿体发育

3．6 atybeY突变体内叶绿体编码蛋白质的含量变化

3．6．1 atybeY突变体光合色素蛋白复合体分析

3．6．2 atybeY突变体的RbcL含量

3．6．3 atybeY突变体叶绿体编码的类囊体复合体亚基的蛋白含量

3．7 atybeY突变体内叶绿体编码基因的转录水平

3．7．1 atybeY突变体内叶绿体编码的蛋白转录水平

3．7．2 atybeY突变体内叶绿体编码trn转录水平

3．8 AtYbeY参与叶绿体rRNA的加工

3．8．1 atybey突变体rRNA的定量分析

3．8．2 atybeY突变体内叶绿体rRNA转录水平分析

3．8．3 atYbeY突变体内叶绿体rRNA操纵子中tRNA转录分析

3．8．4 atybeY突变体内叶绿体rRNA的5’和3’端的加工

3．9 AtYbeY变对叶绿体RNA结合多聚核糖体的影响

3．10 AtYbeY体外酶活性鉴定

3．10．1 AtYbeY的原核表达及纯化

3．10．2 几种底物RNA的体外转录合成

3．10．3 AtYbeY体外酶活性分析

3．11 杨树YbeY基因及其异源回补atYbeY-1突变体

3．11．1 杨树YbeY基因

3．11．2 PtYbeY异源回补突变体及其表型分析

4 讨论

4．1 叶绿体定位YbeY是植物生存的关键遗传因子

4．2 YbeY参与叶绿体rRNA加工和成熟

4．3 YbeY介入叶绿体多种RNA的代谢与调控

4．4 YbeY体内特异性加工rRNA可能依赖于与其相互作用的蛋白因子

4．5 YbeY蛋白影响叶绿体发育

结论

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

声明

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摘要

叶绿体核糖体(Chlororibosomes)是叶绿体编码基因的蛋白质合成的场所，由30S和50S两个核糖体亚基构成的70S核糖体。30S的核糖体小亚基由16S rRNA和20种核糖体蛋白组成，50S的核糖体大亚基由23S、4.5S和5S rRNA与30种核糖体蛋白组成。高等植物叶绿体的四个核糖体RNAs(16S、23S、4.5S和5S rRNA)来源于同一个操纵子，作为多顺反子转录成rRNA前体，再经过加工形成成熟的rRNAs。叶绿体成熟rRNA是其核糖体翻译活性所必要的，一些加工因子和5个核糖核酸酶被报道参与叶绿体rRNA加工和成熟。然而，对于叶绿体rRNA加工和成熟过程及分子模式，人们知道的仍是非常有限。本研究鉴定一个新的核糖核酸酶YbeY参与植物叶绿体rRNA加工和成熟，并影响叶绿体发育。主要研究结果如下:
　　(1)基因数据库同源序列搜索表明，35个已知基因组植物物种均存在和细菌YbeY同源的蛋白，数量1～2个，这些植物YbeY蛋白大多数含有UPF0054和HAD hydrolase-like双结构域，少数的仅含有UPF0054结构域。氨基酸序列一致性分析显示，含有双结构域的植物YbeY大多数含有H3xH5xH motif,而只含UPF0054结构域的植物YbeY基本没有此motif。这表明YbeY蛋白在植物中既有保守性，又显示了进化上的新特征。
　　(2)拟南芥基因组只存在一个YbeY蛋白(At2925870)，GFP分子荧光蛋白标记手段显示AtYbeY定位于拟南芥叶绿体。半定量PCR和荧光定量PCR数据显示，AtYbey基因在拟南芥所有组织中均有表达，在莲座叶和花中较高表达;此外，AtYbeY基因转录表达水平受光调控，但不受热激诱导。
　　(3)遗传学数据显示，与野生型相比AtYbeY基因下调突变体（atybeY-1和AtYbeY-amiRNA）表现为叶色发黄，生长迟缓，AtYbeY基因敲出突变体（atybeY-2）表型为白化致死。这些结果表明AtYbeY对于拟南芥存活和光合自养是必须的。
　　(4)生理生化数据显示，atybeY-1突变体总叶绿素、叶绿体a和b含量及叶绿素a/b比都下降，叶绿素荧光参数Fv/Fm和ETRII显著下降而qN升高。这些生理指标表明atybey突变体光合效率降低。超微结构显示atybeY-1突变体叶绿体基粒和基质类囊体均显著减少，表明其叶绿体发育存在缺陷，
　　(5)用BN-PAGE技术分析显示，atybeY-1突变体光合色素复合体PSII超复合体和PSI单体/PSII双体明显减少;SDS-PAGE分析显示RbcL含量显著下降;Western杂交数据显示叶绿体编码的类囊体复合体亚基蛋白含量显著下降;Northern杂交数据显示叶绿体编码基因的转录水平不受影响。这些结果表明AtYbeY突变影响叶绿体编码基因的翻译水平。
　　(6) Northern杂交数据显示atybeY-1突变体的16S、23S、4.5S和5S叶绿体4种rRNA前体显著积累，而成熟转录产物明显减少，用5'和3'端特异性探针杂交进一步显示前体16S和23S rRNA产物积累。cRT-PCR分析显示16S、23S和4.5S rRNA的5'和3'端序列未被加工切去。这些结果表明AtYbeY参与叶绿体16S、23S、4.5S和5S rRNA加工和成熟。此外，atybeY-1突变体内叶绿体rRNA操纵子的tRNA成熟产物也明显减少，表明AtYbeY也参与这三个tRNA成熟加工。
　　(7) rRNA定量分析显示，atybe Y-1突变体内16S rRNA成熟加工的缺陷影响了叶绿体核糖体30S小亚基装配，成熟23S rRNA的减少也影响了叶绿体核糖体50S大亚基组装。多聚核糖体与mRNA结合实验显示，AtYbeY突变降低叶绿体mRNA与多聚核糖体结合数量。这些结果表明AtYbeY基因突变影响叶绿体核糖体的功能。
　　(8)体外生化数据显示，AtYbeY能剪切叶绿体编码的rRNA，mRNA和tRNA，但不能降解dsDNA和ssDNA，表明AtYbeY是一个核糖核酸酶(RNase)

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