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低氮胁迫下黄瓜幼苗差异表达基因鉴定与蛋白质组学分析

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黄瓜(Cucumis sativus L.)是世界上最重要的蔬菜作物之一。黄瓜栽培上需要施用大量的肥料，尤其是氮肥。氮肥是植物最重要的矿质元素，它是氨基酸、蛋白质、叶绿素、核酸、脂类以及其他重要代谢物质的组成成分。氮素的缺乏会导致植物生长减慢，加速衰老，最终影响经济产量。然而，大量施用氮肥不仅增加的生产成本，还会导致果实硝酸盐过量积累和产生土壤盐渍化。减少肥料的投入的同时提高产品质量而不影响产量是现代农业面临的主要挑战。在前人的实验结果中，我们发现一些栽培品种对低氮胁迫有着较好的耐性。
　　 本研究选用前期试验中鉴定出的耐低氮品种“津研四号”，通过其在转录水平及蛋白质表达水平的差异，研究其在低氮胁迫条件下的应答机制，希望能为揭示黄瓜耐低氮胁迫的机理奠定基础。
　　 为了鉴定黄瓜转录水平对低氮胁迫的应答，本试验分别在正常营养条件以及低氮条件下栽培该黄瓜品种，并选取幼苗叶片进行转录水平的差异比较。通过Solexa测序技术，本试验鉴定出868个响应低氮胁迫的基因，其中654个基因上调表达，214个基因下调表达，包括转录因子、酶基因以及与激素调节相关的基因等。本试验选取了20个氮代谢相关或差异显著的基因进行验证，其中19个基因与表达谱测序结果一致，达到95％，证明表达谱测序结果准确可靠。为了进一步验证测序结果的准确性，对RT-PCR验证结果进行了qRT-PCR验证，本试验选取了已验证的15差异基因进行进一步验证，结果与RT-PCR结果完全一致，进一步证明了表达谱测序结果的可靠性。GO分析结果显示差异表达基因主要涉及“代谢过程”，“细胞”，“结合”，“细胞过程”，“细胞器”以及“催化活性”等。其中，在“含氮化合物代谢过程”中含有62个差异表达基因，其中44个基因上调表达，18个基因下调表达。本试验同时鉴定出了一些富集的Pathway，例如光合作用捕光蛋白质，苯基丙酸类合成，类黄酮的生物合成、氮代谢、光合作用以及苯丙氨酸代谢等途径。
　　 为了鉴定低氮胁迫下黄瓜幼苗蛋白质水平的变化差异，本试验选取与Solexa测序相同的材料进行蛋白质双向电泳分析。用24cm，pH4-7的IPG胶条进行试验，每根胶条上样量为1mg，用12.5%的分离胶进行双向电泳。对照与低氮处理各进行三次重复试验，经过考马斯亮蓝染色后的胶，用扫描仪在300dpi分辨率采集图像。用Imagemaster2D Platinum7.0图像分析软件处理图像，分析差异表达的蛋白质点，并进行质谱检测。结果表明：在低氮胁迫处理下，表达出现明显差异的蛋白质点共有7个。通过质谱分析，对这7个蛋白质进行了鉴定。其中与光合作用有关的蛋白质4个，与激素调控的蛋白质1个，与胁迫反应相关的蛋白质1个，功能未知蛋白1个。与对照相比，低氮胁迫处理下的黄瓜幼苗叶片中，S-腺苷甲硫氨酸合成酶，核酮糖1，6二磷酸羧化酶/加氧酶上调表达，果糖1，6二磷酸酯酶，谷氨酸1-半醛21-氨基变位酶下调表达。

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