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【6h】

胰高血糖素样肽-1受体激动剂筛选模型构建

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目录

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第1章 引 言

1.1 GLP-1R的介绍

1.1.1 GLP-1R的表达

1.1.2 GLP-1R胞外域(ECD)与跨膜域(TMD)的研究

1.2 GLP-1R的功能研究

1.2.1 GLP-1受体激活机制

1.2.3 GLP-1R的生理功能

1.2.4 现有治疗2型糖尿病药物

1.3 课题研究的意义及创新性

1.3.1 课题研究的意义

1.3.2 创新性

第2章 GLP-1R小分子药物筛选细胞模型的建立

2.1 背景介绍

2.2 实验材料

2.2.1 常用材料

2.2.2 实验仪器

2.3 实验方法

2.3.1 重组载体pEGFP-TEV-GLP-1R的构建

2.3.3 重组载体pLenti-CMV-GLP-1R-GFP的构建

2.3.4 瞬转法转染HEK293T分析模型可行性

2.3.5 构建高表达GLP-1R-GFP融合蛋白的HEK293T单克隆细胞株

2.4 实验结果及讨论

2.4.1 重组载体pEGFP-TEV-GLP-1R的构建

2.4.2 重组载体pLenti-CMV-GLP-1R-GFP的构建

2.4.3 瞬转法转染HEK293T分析模型可行性

2.4.4 构建高表达GLP-1R-GFP融合蛋白的HEK293T单克隆细胞株

2.5 本章小结与讨论

第3章 GLP-1R小分子药物筛选蛋白模型的建立

3.1 背景介绍

3.2 实验材料

3.2.1 常用材料

3.3.1 用杆状病毒sf9表达全长GLP-1R

3.3.2 用大肠杆菌表达系统表达GLP-1R

3.3.2 用大肠杆菌表达系统表达GLP-1

3.4 实验结果

3.4.1 用杆状病毒sf9表达全长GLP-1R

3.4.2 用大肠杆菌表达系统表达GLP-1R

3.4 本章小结

第4章 论文总结

参考文献

致谢

附录

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摘要

胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1R)属于G蛋白偶联受体(GPCR),是II型糖尿病的有效治疗靶点之一,它由N端胞外域(ECD)和跨膜域(TMD)以及连接跨膜段的胞内域(ICD)三个结构域组成。随着GLP-1的发现,针对GLP-1类似物及DPP-Ⅳ抑制剂开发的多肽类药物已被广泛用于II型糖尿病的治疗,但是多肽类药物半衰期比较短且需持续静脉注射或皮下注射,可行性较差。而现有开发的口服小分子降糖药物还没能达到预期效果并伴随一定的副作用。所以,本研究旨在建立胰高血糖素样肽-1受体激动剂细胞与蛋白筛选模型从而寻找针对靶点GLP-1R的小分子化合物激动剂。 在本研究中,首先构建了GLP-1R-TEV及GFP的重组载体,将该载体瞬时转染HEK293细胞株,用GLP-1R N端抗体成功检测到目的蛋白的表达并用已经证明有效的药物刺激GLP-1R发现用药物刺激后的细胞内cAMP含量明显高于对照组,成功验证了细胞模型的可行性,并通过稳定转染,获得高表达的稳定细胞株。其次,利用杆状病毒表达系统表达全长GLP-1R全长蛋白,筛选与其结合的小分子化合物。此外利用毕赤酵母表达系统表达多肽连接酶Butelase1并设计底物检测其活性,尝试利用大肠杆菌表达系统分段表达跨膜域并利用多肽连接酶Butelase1将跨膜域进行分段连接得到全长跨膜域蛋白,筛选与跨膜域结合的小分子药物。最后构建pMFH-His-GLP-1重组载体以包涵体的形式表达GLP-1多肽,经表达纯化得到的多肽用于FITC标记。构建该细胞模型与蛋白模型,对天然小分子化合物库进行高通量筛选,筛选得到的小分子化合物将有利于开发新型2型糖尿病治疗药物。 本研究用不同表达体系表达GLP-1R并建立药物细胞与蛋白筛选模型。该药物筛选模型的建立能够为Ⅱ型糖尿病口服小分子药物的开发提供理论基础。

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