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不同嗜热链球菌菌株的胞外多糖合成能力及eps基因簇分析

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第1章 绪论

1.1 课题研究的目的和意义

1.2 国内外在该方向的研究现状及分析

1.3 本课题的主要研究内容

第2章 材料和方法

2.1 材料和仪器

2.2 实验方法

2.3 数据分析

第3章 22株嗜热链球菌的EPS提取及菌株CS6产EPS培养条件的优化

3.1 胞外多糖的提取与测定

3.2 单因素试验优化结果

3.3 Plackett-Burman（PB）试验结果与分析

3.4 中心复合实验设计（CCD）结果与响应面分析

3.5 S. thermophilus CS6产EPS的补充碳源和氮源的优化实验

3.6 本章小结

第4章 22株嗜热链球菌的eps基因簇序列测定

4.1 现已公布eps基因簇的分析与引物设计

4.2 eps基因簇序列的扩增与分析

4.3 本章小结

结论

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的论文

声明

致谢

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摘要

嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus，S.thermophilus）是世界上公认的最具经济价值的同型发酵乳酸菌之一，广泛用于乳制品的生产。嗜热链球菌胞外多糖（Exopolysaccharides，EPS）由于其具有改善乳制品的品质，并已被证实具有抗氧化、抑菌等生物活性，而具有广泛的应用前景。
　　本研究首先采用苯酚硫酸法和3,5-二硝基水杨酸法对从本实验室前期分离获得的22株S.thermophilus CS1～CS22产EPS能力进行评价，比较不同菌株所产EPS含量的差异，从中筛选确定高产EPS的优良菌株CS5、CS6、CS9和CS18。本研究以产EPS含量较高的S.thermophilus CS6为研究对象，对该菌EPS合成条件进行优化。采用单因素实验确定传代次数、接种量、发酵温度、后熟时间和碳源（乳糖、半乳糖、果糖、葡萄糖和蔗糖）等影响因素的范围。利用Plackett-Burman设计来筛选单因素中关键因素；利用响应面的中心复合实验CCD法确定最佳培养条件如下：接种量4.34%，发酵温度44℃，脱脂乳含量10%，后熟时间24h，后熟温度4℃，传代次数3代，乳糖含量为1.7%，并进行验证，得到EPS粗提取物的含量为343.75mg/L，与预测值接近，且比优化前提高了11.64%。
　　本研究通过对S.thermophilus CS6进行补充碳源（麦芽糖、甘露糖、甘露醇、木糖和核糖）和氮源（蛋白胨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏和乳清浓缩蛋白）优化实验，同时对最大影响EPS产量的碳源（麦芽糖）和氮源（大豆蛋白胨）进行梯度实验设计，得到它们的最佳浓度范围，为碳源和氮源的进一步优化做准备，最终为后续即将完成eps基因簇序列分析的全部22株S.thermophilus产EPS的培养条件优化奠定基础。
　　本研究对22株S.thermophilus eps基因簇的测定：首先对已公布的eps基因簇进行分析、归类，并根据其5’端deoD和3’端orf14.9之间基因的保守序列设计引物（共计8对）；分别以22株S.thermophilus的基因组DNA为模板，扩增eps基因簇，对PCR产物鉴定、纯化及测序，序列进行拼接，获得完整的eps基因簇序列。本研究最终得到3株S.thermophilus（CS2、CS6和CS10）完整的eps基因簇序列信息，以及其它菌株大部分eps基因簇片段的序列信息。序列分析发现，菌株 CS2、CS6和CS10均与S.thermophilus ASCC1275菌株（ID:CP006819.1）的eps基因簇具有高度同源性，含有额外的与EPS长度相关的eps2C和eps2D基因，推测有利于EPS的合成；同时含有丰富的糖基转移酶基因，负责葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、UDP-N-乙酰葡萄糖胺和UDP-呋喃半乳糖的转运，有利于形成独特单体组成的EPS。以上研究，为进一步研究eps基因簇在菌株产EPS差异中的作用奠定基础。

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