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线粒体融合分裂异常在PBDE-47致神经细胞线粒体数量改变中的作用

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目的：新型持久性有机污染物2,2’,4,4’-四溴二苯醚（2,2’,4,4’-tetrabromodiphenyl ether，PBDE-47）对儿童的发育神经毒性引起了全世界的广泛关注，但PBDE-47导致神经毒性的机制尚不清楚。前期研究结果显示，神经细胞线粒体是PBDE-47的蓄积部位和作用靶点，且线粒体损伤与PBDE-47发育神经毒性的发生发展密切相关。本研究旨在研究PBDE-47对神经细胞线粒体融合分裂动态过程的影响，并分析其在线粒体数量改变中的潜在作用，从而为进一步阐明PBDE-47的神经毒性机制提供实验依据。 方法：本研究分为体内实验和体外实验两个方面。 在体内实验中，建立发育期低剂量PBDE-47暴露动物模型，将亲代雌性Sprague-Dewley（SD）大鼠随机分为4组，从妊娠前十天开始，以不同剂量的PBDE-47（0.1mg/kg bw、1.0mg/kg bw和10mg/kg bw）进行连续灌胃处理，直至仔鼠出生21天断乳后停止。将2月龄的子代大鼠处死后，低温取其海马组织，并迅速进行固定、包埋和冻存处理。使用透射电子显微镜观察子代雌性大鼠海马神经细胞内的线粒体的结构和数量改变。提取海马组织蛋白，采用Western blot方法检测线粒体融合相关蛋白如线粒体融合蛋白1（Mitofusin1，Mfn1）和线粒体融合蛋白2（Mitofusin2，Mfn2）及视神经萎缩蛋白1（Optic atrophy1，Opa1）和线粒体分裂相关蛋白如动力相关蛋白1（dynamin related protein1，Drp1）和磷酸化动力相关蛋白1（p-Drp1）与分裂蛋白1（Fission1，Fis1）以及融合分裂上游调控分子过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活子1α（peroxisome-proliferator-activated receptor-γcoactivator-1α，PGC-1α）的表达水平。采用免疫组织化学方法检测海马组织CA3区线粒体融合分裂相关蛋白在细胞内的表达。 在体外实验中，用不同浓度PBDE-47（1μmol/L、10μmol/L、20μmol/L）处理PC12细胞24h后，使用透射电子显微镜观察细胞内线粒体的结构和数量改变。利用线粒体心磷脂特异性染料壬基吖啶橙（Nonyl Acridine Orange，NAO）对细胞内线粒体进行标记，利用流式细胞术检测荧光强度的强弱以指示线粒体数量的变化。采用Western blot方法检测线粒体融合相关蛋白Mfn1、Mfn2、Opa1与线粒体分裂相关蛋白Drp1、p-Drp1和Fis1的表达水平。为了研究线粒体融合分裂异常在PBDE-47致PC12细胞线粒体数量变化中的作用，利用线粒体融合促进剂M1（5μmol/L）对细胞进行干预，采用Western blot方法检测线粒体融合分裂相关蛋白Mfn1、Mfn2、和Fis1的表达水平；并利用流式细胞术检测NAO荧光强度反映线粒体数量的变化。 结果：体内实验结果显示，电镜观察到对照组大鼠海马神经细胞内有大量线粒体，线粒体形态未见异常变化，0.1mg/kg bw PBDE-47染毒组神经细胞内线粒体与对照组相比略有减少，形态未有明显异常变化，但1.0mg/kg bw PBDE-47染毒组细胞内线粒体数量明显减少，可观察到明显的线粒体肿胀，而10mg/kg bw PBDE-47染毒组的线粒体的结构损伤进一步加重，数量进一步减少；Western blot结果显示，与对照组相比，10mg/kg bw染毒组线粒体融合蛋白Mfn2、线粒体分裂蛋白Fis1以及PGC-1α蛋白的表达水平均明显降低（P<0.05）；免疫组织化学方法结果显示，与对照组相比，1mg/kg bw和10mg/kg bw PBDE-47染毒组Mfn2、Fis1的表达均明显降低。 体外试验结果显示，电镜下观察到对照组细胞内有大量线粒体，线粒体形态未见异常变化，1μmol/LPBDE-47染毒组细胞内线粒体与对照组相比略有减少，形态未有明显异常变化，但10μmol/L PBDE-47染毒组细胞内线粒体数量明显减少，可观察到线粒体嵴消失、线粒体肿胀等，20μmol/L PBDE-47染毒组线粒体肿胀更加严重，出现线粒体空泡，数量进一步减少；流式结果显示，与对照组相比，10μmol/L和20μmol/L染毒组NAO的荧光强度明显降低（P<0.05）；Western blot结果显示，与对照组相比，10μmol/L和20μmol/L染毒组线粒体融合蛋白Mfn1、Mfn2和Opa1及线粒体分裂蛋白p-Drp1、Fis1的表达水平均呈明显降低（P<0.05）；利用线粒体融合促进剂M1干预后，与单纯PBDE-47染毒组相比，PBDE-47+M1联合组的Mfn1、Mfn2及Fis1蛋白的表达水平均呈明显升高（P<0.05），且NAO的荧光强度也明显升高（P<0.05）。 结论：PBDE-47可引起神经细胞线粒体数量减少，同时抑制线粒体融合分裂蛋白的表达；促进线粒体融合可明显驱动线粒体分裂，进而增加线粒体数量，表明PBDE-47可通过干扰神经细胞内线粒体融合分裂过程，影响线粒体数量。

著录项

  • 作者

    刘路明;

  • 作者单位

    华中科技大学;

  • 授予单位 华中科技大学;
  • 学科 公共卫生
  • 授予学位 硕士
  • 导师姓名 王爱国,张舜;
  • 年度 2018
  • 页码
  • 总页数
  • 原文格式 PDF
  • 正文语种 中文
  • 中图分类 药品;肿瘤学;
  • 关键词

    细胞线粒体; 分裂; 神经;

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