Epac分子对鼠GH3细胞系细胞增殖和生长激素合成分泌及其与细胞外调节蛋白激酶信号通路相互作用的研究

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本文分为以下几个部分进行探讨：
　　第一部分 cAMP诱导的垂体腺瘤 GH3细胞增殖与其下游效应分子PKA和Epac的关系及Epac对GH3细胞增殖的影响
　　目的：验证cAMP激活对大鼠垂体腺瘤GH3细胞增殖的影响，探究其下游效应分子PKA和Epac在其中发挥的作用，证实Epac与GH3细胞系增殖之间的关系
　　方法：首先采用CCK8法，研究 cAMP激活剂Forskolin及PKA和Epac的抑制剂对 GH3细胞增殖的作用。然后以 Epac特异性激活剂8-pCPT-2’-O-Me-cAMP作用于GH3细胞，分别采用CCK8法和EDU法在细胞水平和DNA水平上证实Epac激活对GH3细胞增殖的影响。
　　结果：Forskolin激活cAMP后可以明显促进GH3细胞的增殖，PKA和Epac抑制剂可以分别部分抑制这种促增殖效应，但抑制以后的GH3细胞增殖仍具有统计学差异。8-pCPT-2’-O-Me-cAMP特异性激活 Epac对 GH3细胞产生促增殖作用，且呈浓度依赖效应。
　　结论：cAMP激活对GH3细胞产生的促增殖作用可分别通过其下游效应分子PKA和Epac来实现。单独特异性激活Epac亦可促进GH3细胞增殖。
　　第二部分 Epac激活促进 GH3细胞系 MAPK信号通路磷酸化ERK1/2表达增加但对 CREB磷酸化无影响
　　目的：研究cAMP激活后对GH3细胞内ERK1/2和CREB的影响及其与Epac的关系，探索cAMP-Epac激活后的下游信号传导通路
　　方法：首先分别用PKA和Epac抑制剂作用于GH3细胞后，Western blotting检测Forskolin激活cAMP后对GH3细胞p-ERK1/2和p-CREB表达的影响。然后以Epac激活剂和抑制剂，或SiRNA干预细胞，以及B-Raf抑制剂作用于GH3细胞，Western blotting检测其p-ERK1/2表达的变化。
　　结果：cAMP激活后明显促进GH3细胞p-ERK1/2表达，这种促进作用可分别被PKA和EPAC抑制剂部分抑制。CAMP激活后明显促进GH3细胞p-CREB表达，这种促进作用只能被PKA抑制剂抑制，但不能被Epac抑制剂抑制。Epac特异性激活亦可促进GH3细胞p-ERK1/2表达，药物阻断B-Raf可以抑制这种作用。
　　结论：GH3细胞中，cAMP激活后与MAPK/ERK产生交叉通讯，并促进p-ERK1/2表达增加，这种效应可被PKA和Epac分别介导。cAMP激活对p-CREB促表达作用的影响与Epac无关。cAMP-Epac与MAPK/ERK产生的交叉通讯需要B-Raf的参与。
　　第三部分 Epac激活对 GH3细胞的促增殖作用与 B-Raf及MAPK/ERK信号通路的关系
　　目的：研究Epac激活后对GH3细胞的促增殖作用与MAPK/ERK信号通路的关系及B-Raf在其中发挥的作用
　　方法：使用MAPK/ERK和B-Raf的抑制剂干预GH3细胞，再以Epac特异性激活剂处理细胞，CCK8法检测 GH3细胞增殖水平的变化。Western blotting检测细胞周期蛋白cyclin D3的表达水平改变。
　　结果：细胞水平上， Epac激活对 GH3细胞产生的促增殖作用可以被MAPK/ERK和B-Raf的抑制剂完全抑制。在蛋白水平上，Epac激活促进GH3细胞cyclin D3的表达增加效应也被MAPK/ERK和B-Raf的抑制剂。
　　结论：Epac激活后对GH3细胞的促增殖作用是通过MAPK/ERK的激活来实现的，B-Raf也在其中发挥了介导作用。
　　第四部分 Epac激活对GH3细胞生长激素合成和分泌的作用
　　目的：研究特异性激活Epac后对GH3细胞生长激素合成和分泌的作用。
　　方法：特异性Epac激活剂作用于GH3细胞特定时间，然后以Real-time PCR检测生长激素mRNA表达变化。用酶联免疫吸附试验（Elisa）方法检测GH3细胞胞内和培养基中生长激素的水平。
　　结果：Epac激活后，对GH3细胞生长激素mRNA表达水平、GH3细胞胞内和培养基中生长激素的变化无明显差异。
　　结论：Epac激活对GH3细胞生长激素的合成和分泌无明显作用。

著录项

作者
孙炜;
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作者单位

华中科技大学;

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授予单位华中科技大学;
学科外科学(神经外科)
授予学位博士
导师姓名雷霆;
年度 2017
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总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类垂体肿瘤;肿瘤病理学、病因学;
关键词
垂体腺瘤; 细胞增殖; 生长激素; 蛋白激酶; 激活蛋白直接交流管;

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