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过表达NADP+依赖型苹果酸酶对原始小球藻油脂合成的影响及产油条件优化

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1 绪论

1.1 生物柴油

1.2 微藻油脂合成机制

1.3 微藻基因工程研究现状

1.4 微藻生物柴油面临的挑战

1.5 利用小球藻制备生物柴油研究进展

1.6 本研究的目的及意义

2 原始小球藻中苹果酸酶me基因的克隆

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 结果与分析

2.4 讨论与小结

3 过表达苹果酸酶工程藻的构建

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论与小结

4 过表达ME对原始小球藻油脂合成的影响及培养条件优化

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 结果与分析

4.3 讨论与小结

5 全文总结与展望

5.1 全文总结

5.2 展望

致谢

参考文献

附录1 苹果酸酶me基因序列

附录2 苹果酸酶ME氨基酸序列

附录3 仪器与设备

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摘要

近年，生物柴油因其清洁环保、品质优良、可再生等优势，受到广泛关注而发展迅速。微藻由于其适应性强、生长快、油脂产量较高、不与粮争地等优点，被认为是生产生物柴油的理想原料来源。当前油脂产量低是限制微藻大规模利用的主要因素之一，因此培育高产油微藻藻种对微藻大规模应用具有重要意义。苹果酸酶(malic enzyme,ME)催化苹果酸脱羧生成的NADPH是脂肪酸合成过程中NADPH的重要来源，对油脂合成有着重要作用。为研究ME对微藻油脂积累的影响，本文以原始小球藻(Chlorella protothecoides)为研究对象，利用基因枪轰击法成功构建了过表达ME原始小球藻工程藻，并运用GC-MS分析对比了野生藻和工程藻所产油脂的脂肪酸成分，进一步应用响应面法对工程藻油脂积累培养条件进行了优化。主要研究内容和结果摘要如下。
　　（1）分析和克隆了苹果酸酶me基因序列。分析比对苹果酸酶ME氨基酸保守序列，设计了简并引物，以原始小球藻cDNA为模板，利用简并引物扩增得到me基因部分序列，采用5'-RACE和3'-RACE进一步克隆得到包含me基因的序列，并通过ORF Finder和BLAST确定了编码509个氨基酸的苹果酸酶me基因完整序列。
　　（2）构建了过表达苹果酸酶的基因工程藻。构建表达载体pBI121-me，利用基因枪轰击法，将其转入原始小球藻中，以G418抗生素平板筛选，再经基因组PCR验证，得到工程藻阳性克隆子。利用半定量PCR技术分析了工程藻培养过程中苹果酸酶基因me的转录水平，工程藻细胞破碎液经过蛋白纯化后，通过Western-blot和质谱等方法确定纯化得到的蛋白为苹果酸酶MEHis蛋白。
　　（3）对比分析了野生藻和工程藻所产油脂的脂肪酸成分。采用索氏提取法和GC-MS法，分析了以10g/L葡萄糖为碳源的培养条件下野生藻和工程藻细胞油脂含量和脂肪酸组成成分。其中，野生藻油脂脂肪酸主要成分为：C16:0(23.40％)、C16:2(7.54%)、C16:3(8.58%)、C18:0(2.41%)、C18:1(14.72%)、C18:2(32.98%)、和C18:3(10.37%)；工程藻油脂脂肪酸主要成分为：C16:0(24.53%)、C16:2(8.04%)、C16:3(7.32%)、C18:0(1.52%)、C18:1(14.63%)、C18:2(35.17%)、和C18:3(8.79%)。过表达苹果酸酶ME对油脂脂肪酸组成成分有一定影响，且工程藻内油脂含量相比野生藻提高了34.7%，达到了细胞干重的26.4%。
　　（4）优化了工程藻油脂积累培养条件。通过碳、氮源单因素实验，确定了乙酸钠和硝酸钠分别是工程藻油脂积累的最佳碳、氮源。利用响应面法进一步优化工程藻培养过程中油脂积累条件，得到最佳培养条件为：乙酸钠54.54g/L，硝酸钠651.6mg/L，磷酸氢二钾194.2mg/L。最优培养条件下，工程藻油脂含量较优化前提高了65.5%，达到了细胞干重的43.7%；生物量较优化前提高了43.4%，干重达到了8.36g/L。

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