叶酸偶联白蛋白cypate纳米粒的构建及靶向膀胱癌光热杀伤效应的实验研究

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目的:基于Cypate的光热转换效应，本文构建了一种新型有机光热纳米材料叶酸偶联白蛋白 Cypate（即 FA-BSA-Cypate）纳米颗粒，由于叶酸和 cypate能同时结合于牛血清白蛋白（BSA）的不同位点而被BSA运输到体内，因肿瘤的EPR效应及叶酸与其受体的特异性结合而使膀胱肿瘤细胞更有效地摄取纳米粒中的cypate，体外及体内实验证实FA-BSA-Cypate纳米粒对膀胱肿瘤的靶向光热杀伤效应，探究其作用机制，有望为后期临床应用提供重要的理论基础。
　　方法:（1）合成有机材料Cypate并通过1H-NMR进行表征，溶剂透析法制备叶酸偶联白蛋白Cypate纳米颗粒，透射电子显微镜(TEM)对叶酸偶联白蛋白Cypate纳米颗粒的形态进行表征，动态光散射仪(DLS)测定纳米粒粒径分布，紫外分光光度法测量FA-BSA-Cypate纳米粒载药量，观察不同浓度FA-BSA-Cypate纳米粒溶液(0、1、10、100μg/ml)在808nm激光(1.5W/cm2)照射下温度随时间变化，证实 FA-BSA-Cypate纳米粒的光热升温效应。（2）细胞免疫荧光法检测人膀胱癌5637细胞膜叶酸受体(FA-αreceptor)的表达，紫外分光光度法测定5637细胞对 FA-BSA-Cypate纳米粒、BSA-Cypate纳米粒的摄取量随时间变化，进一步应用激光共聚焦显微镜观察5637细胞对FA-BSA-Cypate纳米粒、BSA-Cypate纳米粒的摄取情况。（3）MTT法比较不同浓度FA-BSA-Cypate复合纳米粒对5637细胞的细胞毒性，MTT法检测FA-BSA-Cypate纳米粒不同浓度、不同光照时间以及不同能量808 nm的近红光照射所诱导的对5637细胞的光热杀伤效应。（4）DHE（Dihydroethidium）染色观察FA-BSA-Cypate纳米粒经近红外光（NIR）照射后细胞内单态氧水平；FA-BSA-Cypate纳米粒联合NIR照射情况下，1,3-二苯基异苯并呋喃（DPBF）的消耗以测定单态氧（1O2）的生成。（5）将细胞分为四组；检测细胞的凋亡率及迁移能力；检测各组凋亡/热休克/增殖相关指标mRNA和蛋白表达变化。（6）考察叶酸偶联白蛋白Cypate在膀胱癌5637细胞荷瘤小鼠体内的抗肿瘤活性，观察肿瘤体积变化等以评价疗效。
　　结果:成功制备了具有良好光热升温特性的FA-BSA-Cypate纳米粒，其粒径为（101.2±9.3）nm，NIR照射纳米粒溶液最高温度可达59℃，且具有浓度依赖性；细胞免疫荧光证实人膀胱癌5637细胞膜高表达叶酸受体(FA-α receptor)；细胞摄取试验表明FA-BSA-Cypate纳米粒对膀胱癌5637细胞的靶向性；MTT显示不同浓度的FA-BSA-Cypate纳米粒作用于5637细胞24h后细胞存活率在95％以上，无明显生物毒性；联合808nmNIR照射下，5637细胞存活率随着纳米粒浓度和激光能量密度的增加而下降，5637细胞存活率也随着激光照射时间的延长而下降；NIR照射条件下，FA-BSA-Cypate纳米粒能够促进单态氧的生成，加重了细胞毒性；流式细胞检测结果显示 FA-BSA-Cypate纳米粒组细胞凋亡率显著增高；transwell法检测结果表明FA-BSA-Cypate纳米粒组细胞的迁移能力显著下降；qRT-PCR及Western blot结果显示，FA-BSA-Cypate+激光组热休克及凋亡蛋白表达显著增高，而促增殖蛋白的表达明显降低。NIR照射下，FA-BSA-Cypate纳米粒对5637细胞荷瘤裸鼠皮下移植肿瘤的生长具有显著的抑制作用。
　　结论:有机纳米材料FA-BSA-Cypate纳米粒毒性低、肿瘤细胞靶向性强；体外及体内实验表明 FA-BSA-Cypate纳米粒介导的靶向光热疗法对膀胱癌具有良好的靶向杀伤效果，能有效抑制5637细胞的增殖并促进其凋亡。本研究为将来临床应用基于FA-BSA-Cypate纳米粒的膀胱癌的靶向光热治疗奠定了一定的理论基础。

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作者
朱伟;
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作者单位

华中科技大学;

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授予单位华中科技大学;
学科泌尿外科
授予学位博士
导师姓名曾甫清;
年度 2016
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类膀胱肿瘤;手术（外科）疗法;
关键词
膀胱癌; 靶向治疗; 叶酸偶联白蛋白; 纳米颗粒; 光热杀伤效应;

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