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Toll样受体4在系统性红斑狼疮患者外周血单核源性巨噬细胞上的表达以及在其产生白介素6上的作用

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系统性红斑狼疮（SLE）是一种常见的自身免疫性疾病，免疫细胞的功能紊乱及免疫因子的网络失衡在狼疮的病理过程中起重要的作用。经检测SLE患者外周血和病理组织中有多种免疫因子表达水平异常，其中白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）在SLE中占有重要的一席。IL-6是一个多效的细胞因子，在免疫调节和炎症反应中具有广泛的生物学活性。可以导致B淋巴细胞分化为抗体形成细胞，并促使T细胞成为效应细胞。IL-6具有很多强大的促炎症效应。在狼疮鼠的模型中，阻断IL-6可以改善各种模型鼠的病情。最近的数据表明IL-6在B细胞的高度活化和人类狼疮的免疫病理和组织损伤中具有重要的作用。SLE患者外周血中IL-6自发性水平升高，其机制尚不明确。 细菌，尤其是格兰氏阴性菌以及病毒感染是狼疮诱发和加重过程中的重要因素。但是，是否感染是确切的SLE诱发因素以及感染是如何诱发SLE患者发生免疫紊乱的，目前尚有争议。哺乳动物感知外来微生物的入侵主要是依靠模式识别受体（pattern recognized receptors,PRRs），其中最重要的PRRs就是Toll样受体（toll like receptors,TLRs）。Toll样受体4（TLR4）是近年来发现的识别格兰氏阴性菌产物脂多糖（lipopolysaccbaride，LPS）的一种主要蛋白，是桥接机体天然抗感染反应及适应性免疫的一种重要的分子。本研究的目的是：1.评价人外周血单核细胞源性的巨噬细胞的TLR4的表达情况，探讨感染和SLE的关系。2.初步研究TLR4在感染引起机体免疫反应中的作用和信号传导，提出在细胞水平阻断感染引起狼疮异常免疫反应的可能性，并为控制狼疮的病理提供可能的治疗靶点。 实验一 TLR4介导LPS对于外周血单核细胞源性的巨噬细胞的激活 目的:探讨TLR4在LPS激活巨噬细胞中的作用及信号转导途径。 方法:分离正常外周血中单核细胞，体外培养成巨噬细胞，分为3组：1.培养基组。2.LPS组，细胞培养30min后加入终浓度10ng/ml 的LPS培养过夜。3.培养基+ LPS+TLR4阻断剂。细胞加入终浓度分别为5μg/mL, 20μg /mL, 30μg /Ml的TLR4阻断剂孵育30min, 120min后中止反应，再加入10ng/ml 的LPS培养过夜。所得细胞分别检测NF-κB的活性变化，并在上述分组细胞培养8h后收集上清液，ELISA法测IL-6浓度。 结果:培养基组、LPS+培养基组、LPS+培养基+TLR4阻断剂(终浓度分别为和5μg/mL, 20μg /mL, 30μg /mL)组NF-κB相对活性分别为27.7±3.3，76.6±11.1,65.1±7.6；28.1±4.9,24.7±2.9。培养基组、LPS+培养基组、LPS+培养基+TLR4阻断剂组(终浓度分别为5μg /mL,20μg /mL, 30μg /mL)组IL-6水平: 48.08±11.2, 2234.71±63.5, 887.09±24.8,348.54±20.1, 299.43±19.9，组间两两比较差异有显著性(P<0.05或P<0.01). 结论:TLR4介导LPS对于外周血单核细胞源性的巨噬细胞的激活。最终激活NF-κB。TLR4的激活可以导致血清IL-6水平的升高，TLR4在感染引起IL-6的升高，并发挥其免疫效应中起关键的作用。 实验二 SLE患者外周血单核细胞源性的巨噬细胞TLR4 mRNA变化及其意义 目的: 探讨SLE患者外周血单核细胞源性的巨噬细胞TLR4变化规律及意义，为感染与SLE发病的联系寻找进一步的理论依据。 方法: 选取SLE病人17例。清晨空腹抽取外周静脉血10ml，分离单个核细胞(PBMC)及进一步分离单核细胞，与上个实验相同的条件体外培养成巨噬细胞。同样分为培养基组和LPS+培养基组。RT-PCR检测细胞TLR4 mRNA的表达化；ELISA法检测培养上清液中IL-6的浓度变化。 结果:与正常组比较，SLE外周血单核细胞源性的巨噬细胞TLR4的表达上调，IL-6的浓度升高（P<0.05）。且在LPS的刺激下，SLE外周血单核细胞源性的巨噬细胞的TLR4 mRNA和IL-6也均升高。 结论: SLE外周血单核细胞源性的巨噬细胞的TLR4介导SLE的炎症反应，其表达数量与机体免疫状态有关。 实验三 TLR4阻断剂对SLE外周血单核细胞源性的巨噬细胞炎症水平的影响 目的:验证阻断TLR4受体是否可以显著降低SLE外周血单核细胞源性的巨噬细胞的NF-κB的活性和IL-6的产生，从而减轻SLE异常的炎症反应。 方法:24孔培养板中加入体外培养的SLE外周血单核细胞源性的巨噬细胞(2×105/孔，400μl)，分别加入等体积培养基、TLR4阻断剂(终浓度分别为和5μg /mL, 20μg /mL, 30μg /mL)孵育，120min后中止反应，检测NF-κB的活性变化和IL-6的水平变化。 结果: NF-κB的相对活性分别为30.1±7.9；27.1±4.1,25.2±2.8，22.8±2.4。各组之间NF-κB的相对活性没有显著性变化，P>0.05。IL-6的水平分别66.11±12.2, 42.18±10.2，31.08±7.2，25.32±6.4。TLR4抗体可以显著降低SLE外周血单核细胞源性的巨噬细胞IL-6的产生，且呈现剂量-效应关系，两两比较P<0.05。 结论:TLR4阻断剂可以显著影响SLE外周血单核细胞源性的巨噬细胞分泌IL-6，IL-6的产生的主要是TLR4依赖性的；而TLR4阻断剂并不能显著抑制SLE外周血单核细胞源性的巨噬细胞导致的NF-κB的活性变化。

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