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【6h】

猪多杀性巴氏杆菌重要蛋白的表达及免疫原性研究

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参考文献

缩略词表(Abbreviation)

1 文献综述

1.1多杀性巴氏杆菌病原学概述

1.2多杀性巴氏杆菌病概述

1.2.1多杀性杆菌感染禽类的致病性

1.2.2多杀性巴氏杆菌感染牛的致病性

1.2.3多杀性巴氏杆菌感染家兔的致病性

1.2.4多杀性巴氏杆菌感染猪的致病性

1.2.5多杀性巴氏杆菌感染人的致病性

1.3多杀性巴氏杆菌疫苗研发及使用现状

1.3.1灭活疫苗

1.3.2减毒活疫苗

1.3.3亚单位疫苗

1.3.4 DNA疫苗

2 研究目的及意义

3.1 实验材料

3.1.1 菌株和质粒

3.1.2 实验动物

3.1.3 工具酶与试剂

3.1.4 培养基与抗生素

3.1.5 主要溶液配置

3.1.6 主要仪器与设备

3.2.1 重组质粒的构建及鉴定

3.2.2 重组蛋白的原核表达

3.2.3 重组蛋白的免疫原性分析

3.2.4 CBA技术检测小鼠血清细胞因子水平

4 实验结果与分析

4.1 重组表达质粒的构建及鉴定

4.1.1 目的基因的PCR扩增

4.1.2 重组质粒的PCR鉴定

4.1.3 重组质粒的双酶切鉴定

4.2 重组蛋白的表达

4.3 重组蛋白免疫保护率的测定

4.3.1小鼠致死剂量的确定

4.3.2重组蛋白免疫保护力小鼠实验结果

4.3.4 间接ELISA方法检测抗体水平

4.3.4 CBA技术检测小鼠血清细胞因子水平

5 讨论和结论

5.1 讨论

5.2 结论

参考文献

致谢

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摘要

多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)是一种重要的病原菌,感染宿主谱广,所导致的疾病类型多。感染猪的多杀性巴氏杆菌主要为A型和D型,可引起猪肺疫和猪萎缩性鼻炎。目前市面是主要用于预防多杀性巴氏杆菌病的疫苗是灭活疫苗,其次是减毒活疫苗。但是灭活疫苗最显而易见的确定是不能提供不同血清型的交叉免疫保护力。减毒活疫苗的主要缺点是存在毒力返强的潜在危险,而且可能会导致动物组织损伤。亚单位疫苗是近来研究的热点。外膜蛋白是革兰氏阴性菌的重要组成成分。有些外膜蛋白已经陆续被证实可以作为免疫动物的候选抗原。更重要的是,外膜蛋白在不同血清型菌株中具有高保守性,提示同一种外膜蛋白可以提供抵抗不同血清型Pm的交叉免疫保护,解决现如今灭活疫苗保护效果单一的问题。
  本研究主要内容包括:⑴重组蛋白rOmp87、rOmpA、rVacJ、rOmpH、rPlpE的克隆表达。根据Genbank公布的基因序列,设计特异性引物,扩增Omp87、OmpA、VacJ、OmpH、PlpE基因片段,连接至表达载体pET-20b(+),构建重组表达载体pET20b-Omp87、pET20b-OmpA、pET20b-VacJ、pET20b-OmpH、pET20b-PlpE,成功表达重组蛋白 rOmp87、rOmpA、rVacJ、rOmpH、rPlpE。重组蛋白均表达在包涵体中。用0.1-1mM不同浓度梯度的IPTG诱导表达,蛋白均表达在包涵体中。对包涵体蛋白进行变性复性和纯化,SDS-PAGE验证蛋白成功表达。而且蛋白表达非常高效,低浓度IPTG诱导同样可以大量表达。⑵重组蛋白免疫原性评价。以8-9周龄的BALB/C小鼠为动物模型,以分离自病猪肺脏组织的PmA和PmD两种血清型为攻毒毒株,分别测定了PmA对小鼠的最小致死剂量为80CFU/只,PmD对小鼠的最小致死剂量为2×106CFU/只。表达成功的重组蛋白,与氢氧化铝佐剂充分混合,皮下多点注射免疫4-5周龄BALB/C小鼠,免疫剂量为50μg/只,一免14天后加强免疫,免疫剂量与一免相同。同时设置PBS和PBS+佐剂两组阴性对照,以及PmA灭活疫苗和PmD灭活疫苗两组阳性对照。二免之后14天分别用PmA和PmD两种血清型的菌株攻毒,攻毒剂量为PmA160CFU/只,PmD4×106CFU/只。结果显示,PmA攻毒之后,重组蛋白rOmpH可以为小鼠提供62.5%的保护率,重组蛋白rOmpH与重组蛋白rVacJ联合使用可以为小鼠提供12.5%的保护率,其他重组蛋白不能提供保护力,PmD灭活疫苗不能提供交叉免疫保护,保护率为0;PmD攻毒之后,重组蛋白rVacJ、rOmpH、rOmpA分别可以提供87.5%、75%、50%的免疫保护率。灭活疫苗PmD可以提供100%的免疫保护率,但是PmA灭活疫苗不能够提供交叉免疫保护,保护率为0。本研究成功筛选到对PmA和PmD两种血清型菌种具有交叉免疫保护力的重组蛋白rOmpH。

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