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表达猪病毒性腹泻主要抗原的重组乳酸菌的构建及免疫原性分析

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缩略语表 (Abbreviation Table)

1 文献综述

1.1 什么是益生菌

1.2 益生菌的功能

1.3 益生元

1.4 益生菌与免疫调节

1.5 肠道微生物菌群与粘膜免疫

1.6 乳酸菌

1.7乳酸菌对猪肠道屏障功能的调节

1.8 乳酸菌作为疫苗载体的巨大潜力

1.9 猪病毒性腹泻

2目的及意义

3 材料和方法

3.1 菌种、质粒和毒株

3.2相关试剂配制

3.3主要酶和试剂

3.4主要仪器和设备

3.5 GFP-pMG36e、PEDV-S318-pMG36e和 TGEV-S600-pMG36e重组载体构建

3.6重组乳酸乳球菌和空载菌的构建及其表达鉴定

3.7 小鼠灌胃免疫特异性抗体水平检测

3.8仔猪口服免疫试验

4结果与分析

4.1重组载体构建的PCR、双酶切及重组乳酸菌蛋白表达鉴定

4.2小鼠灌胃免疫特异性抗体水平检测

4.3仔猪口服免疫评估

5 讨论

5.1宿主菌的选择

5.2表达载体的选择和优化

5.3 乳酸菌的外源蛋白的表达形式在粘膜免疫应用的探讨

5.4浅谈乳酸乳球菌对仔猪的细胞因子水平的免疫调控

6 结论

参考文献

附录

致谢

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摘要

本研究利用乳酸乳球菌MG1363作为活菌载体，运用其组成型表达载体pMG36e构建并成功表达PEDV和TGEV的部分纤突S抗原蛋白，筛选表达量相对较高的重组乳酸菌分别口服免疫BALB/c雌性小鼠和25日龄断奶仔猪，并取得良好的免疫效果。双抗夹心ELISA检测BALB/c小鼠血清中特异性IgG抗体和肠道粘液中的特异性sIgA抗体水平，结果显示，相对于PBS空白组和pMG36e-MG1363空载菌组，两种重组乳酸菌组均能分别在血清和肠道粘液中检测到高滴度的特异性IgG抗体和粘膜sIgA抗体，抗体滴度均在第28d达到峰值；随后进行免疫小鼠肠粘膜刮取液的细胞中和试验，实验结果表明，灌胃免疫重组乳酸菌的小鼠肠粘膜产生的特异性sIgA抗体，比PBS对照组和pMG36e-MG1363空载菌组更能显著抑制病毒感染Vero细胞。断奶仔猪的口服免疫试验发现，在免疫仔猪血清和唾液中亦能分别检测出一定滴度的特异性IgG和sIgA抗体，证明饲喂重组乳酸乳球菌亦能激发仔猪肠粘膜产生特异性的抗体；仔猪血液中细胞因子检测结果发现，饲喂乳酸菌后仔猪的IL-4细胞因子表达水平与PBS对照组相比在第7d和第14d略有升高，但并不显著（P＞0.05）；IL-2、IFN-γ的表达水平在饲喂后上升较明显（P＜0.05），表明饲喂乳酸菌能激发仔猪体内的 Th0细胞主要向 Th1细胞分化，增强仔猪的细胞免疫应答；与PBS空白组仔猪相比，饲喂组仔猪的IL-6表达水平在第14d显著升高，IL-10表达水平在第3d无明显差异（P＞0.05），在第7d和14d升高显著（P＜0.05），IL-17A的表达水平在第3d和第7d有所升高（P＜0.05），在第14d显著升高（P＜0.01）。仔猪免疫攻毒试验结果显示，PBS对照组的4头仔猪的十二指肠、空肠、回肠肠粘膜均有不同程度的坏死、脱落，粘膜下层和固有层的淋巴细胞增生，并伴有淋巴细胞坏死现象；pMG36e-MG1363空载乳酸菌组有3头仔猪的十二指肠、空肠、回肠肠粘膜均出现病变，另1头仔猪的回肠有病变，十二指肠和空肠完整性较好；而PEDV-S318-MG1363重组乳酸菌组5头中只有2头仔猪回肠肠粘膜有坏死、脱落等病变；试验表明，口服免疫PEDV-S318-MG1363重组乳酸菌的仔猪肠道产生保护性sIgA抗体并能在一定程度上抵抗PEDV的感染，保护率达到60％。

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