2014年～2015年部分省区猪源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定

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多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，Pm）能感染牛、禽、猪、羊、兔、宠物和野生动物，导致感染动物发生巴氏杆菌病（Pasteurellosis），主要包括败血症和呼吸系统疾病。多杀性巴氏杆菌的血清型众多，依据荚膜抗原的不同可被分为A、B、D、E、F五种血清型，不同的血清型可能导致不同临床症状的巴氏杆菌病。猪是多杀性巴氏杆菌的易感动物之一，临床上最常见的两种猪多杀性巴氏杆菌病包括主要由A型多杀性巴氏杆菌导致的猪肺疫和D型产毒素多杀性巴氏杆菌导致的猪萎缩性鼻炎（Porcine atrophic rhinitis, PAR）。除此之外，多杀性巴氏杆菌还常与其他病原体协同感染，共同导致猪呼吸道疾病综合征（Porcine respiratory disease complex, PRDC）。多杀性巴氏杆菌的爆发和流行已严重制约了我国和世界养猪业的健康发展。本文针对我国猪群开展多杀性巴氏杆菌的分离及鉴定，重点研究了多杀性巴氏杆菌在我国猪群中的携带情况、优势血清型、毒力基因的分布情况及我国猪源多杀性巴氏杆菌分离株的遗传进化关系；在此基础上针对多杀性巴氏杆菌的主要免疫原性蛋白进行克隆表达和免疫学特性研究，从而为开展多杀性巴氏杆菌的流行病学调查和亚单位疫苗的研制奠定基础。
　　本研究主要内容包括：⑴2014年~2015年从全国10余省180份临床肺脏病料中共分离到71株多杀性巴氏杆菌，分离率为39.4％；利用PCR技术对所分离的多杀性巴氏杆菌进行荚膜血清型分型，共分离A型多杀性巴氏杆菌41株（58%）；D型多杀性巴氏杆菌27株（38%），包括1株产毒素多杀性巴氏杆菌（1.41%）；3株F型多杀性巴氏杆菌（4%）。⑵应用PCR方法扩增多杀性巴氏杆菌毒素基因（toxA），粘附基因（ptfA，fimA， hsf-1，hsf-2，pfhA，tadD），铁摄取基因（exbB，exbD，tonB，hgbA，hgbB，Fur），唾液酸酶基因（nanB，nanH），透明质酸酶基因（pmHAS），外膜蛋白基因（ompA， ompH，oma87，plpB），超氧化物歧化酶基因（sodA，sodC，tbpA）等23种毒力基因，分析这些毒力基因在多杀性巴氏杆菌不同血清型中的分布情况。结果显示：各毒力基因总检出率和在不同荚膜血清型中的检出率均有较大差别。其中ptfA、fimA、hsf-2、sodA、sodC、ompA、ompH、oma87、plpB、exbB、tonB、Fur、hgbB的检出率在90%以上。而toxA基因检出率较低（1.41%），且未检测到tbpA基因。在粘附基因中，fimA、ptfA、hsf-2、tadD检出率显著高于hsf-1、pfhA的检出率（P<0.01）。超氧化物歧化酶相关基因sodA、sodC检出率与tbpA的检出率差异极显著（P<0.01）。铁摄取基因 exbB、tonB、Fur、hgbB的检出率显著高于 hgbA和 exbD的检出率（P<0.01）。唾液酸酶基因nanB、nanH虽然总检出率不高，且无显著性差异，但nanB在A型中的检出率显著高于在D型中的检出率（P<0.01）。透明质酸酶基因pmHAS及粘附基因tadD在荚膜型为A型的多杀性巴氏杆菌检出率显著高于在D型多杀性巴氏杆菌检出率（P<0.01），hsf-1在D型多杀性巴氏杆菌的检出率与A型多杀性巴氏杆菌差异极显著（P<0.01）。⑶对所分菌株16S rRNA进行扩增及测序，然后用生物学软件（MEGA5.0）对所测16S rRNA序列和NCBI上公布的10株多杀性巴氏杆菌16S rRNA进行进化树分析。表明所分离的多杀性巴氏杆菌与NCBI上公布的16S rRNA的序列同源性非常接近，且分为两个亚群，其中一个主要以HB03和Pasteurella multocida3480等为主的亚群，另外一个为以HN06、Pasteurella muotocida P52、Pasteurella muotocida36950等8株为主的亚群。对所分离的多杀性巴氏杆菌与分离地区及荚膜血清型在进化树上进行分析，结果均无显著的相关性。⑷参考HB03的D15（登录号：CP003328.1）基因及HN06的toxA（登录号：CP003313.1）基因设计引物，分别扩增其目的片段，并对所扩增序列进行了序列分析，成功构建了pET28a-D15及pET28a-toxA-C质粒，诱导及纯化后，经Western blot验证能够与所制备小鼠血清发生特异性反应；44只6~8周龄的昆明小鼠被随机分为A、B、C、D4组。A组与B组每组16只，分别皮下注射200μL（含蛋白40μg）含有的Al(OH)3佐剂的D15蛋白疫苗与PMT-C蛋白疫苗。C组6只，注射等体积Al(OH)3佐剂；D组6只，注射等体积的pH=7.4的PBS。二免后14天分别用2LD50进行攻毒，经小鼠实验表明制备的疫苗安全、可靠；而且 D15可以为小鼠提供75%同源保护力和62.5%异源保护力，而PMT-C可以提供75%同源保护力和25%异源保护力，具有一定的开发前景。

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作者
王庚;
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作者单位

华中农业大学;

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授予单位华中农业大学;
学科兽医
授予学位硕士
导师姓名吴斌,汤细彪;
年度 2015
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类猪;
关键词
生猪养殖; 细菌感染; 巴氏杆菌; 菌株鉴定;

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