首页> 中文学位 >苏云金芽胞杆菌Cry51Aa1杀虫晶体蛋白结构及功能研究
【6h】

苏云金芽胞杆菌Cry51Aa1杀虫晶体蛋白结构及功能研究

代理获取

目录

声明

摘要

缩略语表

第一章 前言

1 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白结构与功能研究进展

1.1 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白的概述

1.2 苏云金芽胞杆菌三结构域型Cry晶体蛋白结构与功能研究

1.3 苏云金芽胞杆菌Cyt型晶体蛋白结构与功能研究

1.4 苏云金芽胞杆菌Parasporin型晶体蛋白结构与功能研究

1.5 小结

2 蛋白质的X射线衍射晶体学概述

2.1 生物大分子结构研究方法概述

2.2 蛋白质的结晶

2.3 X射线衍射理论概述

3 Cry51Aa1杀虫晶体蛋白的研究目的和意义

第二章 苏云金芽胞杆菌Cry51Aa1杀虫晶体蛋白的结构研究

1 引言

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

3 结果与讨论

3.1 蛋白基本信息的预测和分析

3.2 蛋白表达与纯化结果分析

3.3 蛋白浓度的测定与保存

3.4 蛋白酶酶解反应结果

3.5 蛋白晶体生长

3.6 晶体衍射数据收集

3.7 相位信息的确定

3.8 结构解析

3.9 结构修正

3.10 蛋白结构注册

3.11 结构数据质量统计分析

3.12 Cry51Aa1蛋白的单体结构特征

3.13 Cry51Aa1蛋白的二聚体结构特征

3.14 分析超速离心法测定蛋白聚集状态

3.15 羧基端酶解导致Cry51Aa1蛋白由二聚体裂解为单体

3.16 结构域Ⅰ芳香族氨基酸的作用

3.17 丝氨酸/苏氨酸的作用

3.18 甘氨酸Loop

3.19 两亲性发卡结构

4 本章小结

第三章 苏云金芽胞杆菌Cry51Aa1杀虫晶体蛋白的功能研究

1 引言

2 材料与方法

2.1 Cry51Aa1杀虫晶体蛋白对马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)幼虫杀虫活性研究

2.2 Cry51Aa1杀虫晶体蛋白对冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)A955细胞系的毒性研究

3 结果与讨论

3.1 Cry51Aa1杀虫晶体蛋白对马铃薯甲虫幼虫的杀虫活性

3.2 Cry51Aa1杀虫晶体蛋白与Cry51Aa2蛋白比较分析

3.3 Cry51Aa1杀虫晶体蛋白对冈比亚按蚊A955细胞系的溶细胞毒性

4 小结

第四章 总结与展望

参考文献

已发表的论文

致谢

展开▼

摘要

1991年首例Cry3Aa蛋白结构成功解析以来,苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白结构生物学研究的不断深入,有力地推动了蛋白作用机制等研究领域的快速发展,促进了苏云金芽胞杆菌在农林业中更加广泛的应用。为了进一步揭示新型杀虫晶体蛋白的结构,探索杀虫蛋白的作用机理,扩大苏云金芽胞杆菌的应用范围,缓解与防治田间害虫中出现的抗性,本研究以我室新克隆表达的Cry51Aa1蛋白为对象,利用X射线晶体学衍射技术,较全面而深入地开展了结构及功能的探索。
  本研究主要内容包括:⑴解析出与经典三结构域型Cry蛋白不同,且对马铃薯甲虫幼虫有特异性毒性的Cry51Aa1全长蛋白结构。创建了苏云金芽胞杆菌新颖蛋白结构与杀虫活性之间的新型关系,此项研究国内尚未见诸报道。同时,将已解析的苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白结构的分辨率刷新至1.65(A)。⑵Cry51Aa1蛋白结构主要由β折叠股组成,按结构特性可分为三个结构域:结构域Ⅰ位于整个结构的氨基端,由α螺旋、310螺旋和β折叠股组成;结构域Ⅱ位于整个结构的中段,由β发卡和β片层构成;结构域Ⅲ位于整个结构的羧基端,含有两个β片层。结构域Ⅱ和结构域Ⅲ均呈‘β三明治’构象。⑶Cry51Aa1蛋白三个结构域具有其自身的特点:结构域Ⅰ富含芳香族氨基酸,可能与受体结合以及结构稳定性相关;结构域Ⅱ富含色氨酸与苏氨酸,并含有一个两亲性β发卡结构和一段甘氨酸loop,这些模块可能参与蛋白的多聚和跨膜穿孔过程;结构域Ⅲ含有完整的羧基尾端,与蛋白酶酶解活化过程紧密联系。⑷Cry51Aa1在非对称单元内以单体形式存在,但在晶体与溶液中呈晶体学二聚体状态。对结构进一步分析表明,Cry51Aa1蛋白经胰蛋白酶酶解活化后,二聚体内分子间氢键被破坏,二聚体裂解形成单体,单体聚集产生六聚体,六聚体可能是蛋白与细胞膜相互作用时的多聚形态。酶解亦会破坏蛋白单体内各结构域之间的氢键,从而影响两亲性β发卡结构的稳定性。⑸根据螺旋和β折叠组成及分布特点的相似性,三维结构空间分布相似性、以及典型的两亲性β发卡结构特征,将Cry51Aa1蛋白归类于Aerolysin型β穿孔蛋白家族中。同时,比较了Cry51Aa1蛋白单体三结构域与Aerolysin型β穿孔蛋白家族成员结构的异同。⑹功能性实验初步表明,Cry51Aa1蛋白对马铃薯甲虫幼虫有较高的杀虫活性。对鞘翅目昆虫的活性实验验证了Cry51A类蛋白的杀虫谱,使之成为结构新颖、且对鞘翅目有特异性杀虫活性的一类苏云金芽胞杆菌伴胞晶体蛋白;对冈比亚按蚊幼虫细胞系的毒性测定发现,经酶解Cry51Aa1蛋白处理的细胞出现气球样变的现象,说明蛋白能影响细胞膜的完整性,即活化后的Cry51Aa1蛋白具有溶细胞活性。
  本研究利用结构生物学研究手段,摸索并提炼出了一套适用于苏云金芽胞杆菌伴胞晶体蛋白表达体系的蛋白纯化、结晶、X射线衍射、结构解析的完整技术路线。结构新颖的Cry51Aa1杀虫晶体蛋白为苏云金芽胞杆菌结构生物学的研究增添了新的成员,也提供了新的研究思路;功能性结果验证并拓宽了Cry51Aa类蛋白的功能范围,不仅证实了Cry51A类蛋白与鞘翅目和半翅目昆虫细胞膜之间存在特异的相互作用,也暗示了该类蛋白在昆虫细胞膜上的作用方式可能与Aerolsyin型β穿孔蛋白家族类似。对Cry51Aa1杀虫晶体蛋白结构的深入研究和分析,为今后进一步阐明Cry51A类蛋白结构与功能的关系、作用机理的研究,以及害虫生物防治奠定了一定的基础。本文在阐述Cry51Aa1杀虫晶体蛋白结构及功能研究之前,对目前苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白结构与功能的研究进展情况作了一个较为详尽的综述。综述着力分析、归纳和总结了苏云金芽胞杆菌三类不同结构特征晶体蛋白的特点;比较分析了相似蛋白结构与相应功能的异同;探索了杀虫晶体蛋白的作用机制,为Cry51 Aa1蛋白结构与功能的研究提供了思路和经验。同时,为凸显现代结构生物学的特点,本论文对蛋白质的X射线晶体学基本概念与研究方法也进行了简要概述。

著录项

相似文献

  • 中文文献
  • 外文文献
  • 专利
代理获取

客服邮箱:kefu@zhangqiaokeyan.com

京公网安备:11010802029741号 ICP备案号:京ICP备15016152号-6 六维联合信息科技 (北京) 有限公司©版权所有
  • 客服微信

  • 服务号