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梨抗黑星病类似基因Hcrp和启动子克隆与类受体蛋白分析

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目录

文摘

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缩略词表(Abbrcviations)

第一章 文献综述

1 梨黑星病研究现状

1.1 梨黑星菌病原

1.2 梨黑星菌的产孢及传播

1.3 入侵机制、发病条件和预测预报

1.4 梨黑星病抗性机理的研究

2 植物启动子研究进展

2.1 植物基因启动子的结构特征

2.2 启动子的类型

2.3 启动子的研究方法

3 类受体蛋白(receptor-like protein, RLP)

3.1 类受体蛋白的结构

3.2 类受体蛋白的功能

4 生物信息学在植物抗病研究中的应用

4.1 核酸结构和功能预测

4.2 蛋白质结构和功能预测

5 本研究的目的和意义

第二章 梨抗黑星病基因Hcrp克隆和生物信息学分析

1 前言

2 材料与试剂

2.1 材料

2.2 试验试剂

2.3 主要仪器

3 试验方法

3.1 DNA提取及检测

3.2 RNA提取(CTAB法)

3.3 cDNA第一条链合成

3.4 引物设计

3.5 Hcrp基因同源克隆

3.6 产物回收、克隆及测序

3.7 生物信息学分析

4 结果分析

4.1 Hcrp基因PCR扩增

4.2 ORF预测和系统树分析

4.3 LRR分析

4.4 编码区域预测结果

5 讨论

5.1 Hcrp基因结构分析

5.2 Hcrp基因抗病性分析

5.3 同源序列克隆抗病基因

第三章 Hcrp启动子克隆和生物信息学分析

1 前言

2 材料与试剂

2.1 材料

2.2 试验试剂

3 试验方法

3.1 DNA提取及检测

3.2 Hcrp启动子克隆

3.3 产物回收、克隆及测序

3.4 生物信息学分析 

4 结果分析

4.1 同源PCR扩增Hcrp基因启动子

4.2 PCR验证所克隆的启动子

4.3 生物信息学分析所克隆的启动子序列

5 讨论

第四章 类受体蛋白分析

1 前言

2 材料与试剂

2.1 材料

2.2 试验试剂

3 试验方法

3.1 DNA提取及检测

3.2 引物设计

3.3 RLP序列克隆

3.4 产物回收、克隆及测序

3.5 生物信息学分析

4 结果分析

4.1 RLP扩增

4.2 系统进化分析

4.3 序列比对

4.4 组内和组间Ka/Ks(异义替换/同义替换)分析

4.5 核苷酸多样性和Ka/Ks分析

4.6 群体遗传多样性分析

5 讨论

参考文献

致谢

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摘要

梨在我国具有广泛而悠久的栽培历史。梨黑星病(Venturia nashicola Tanak etYamamota)是世界性梨树的重要病害,在我国南北梨区均有发生,尤其在河北、山西、陕西等地危害严重,主要危害梨叶片和果实,造成早期落叶和幼果畸形等,严重影响了梨果品的产量和品质,阻碍了梨产业的发展。因此抗病育种是控制病害的最根本、最有效的方法之一,随着生物技术的迅速发展,为梨抗病育种提供了新的途径,不仅缩短了育种周期、加快了育种进程、拓宽了育种范围,而且解决了传统育种中梨自交不亲和、童期长等困难,然而在梨抗黑星病基因工程方面的研究尚未见报道。
   本文旨在分离梨抗黑星病基因Hcrp及其启动子,并运用生物信息学对其进行了全面的功能预测分析。在此基础上,又对18个梨品种的抗病基因进行了遗传变异研究,主要研究结果如下:
   1.利用同源克隆技术,在翠冠梨上分离出一个抗黑星病基因Hcrp,全长3055bp,包含一个2928bp的开放阅读框(ORF),不含有内含子,编码975个氨基酸。其编码的蛋白质大小为109.4kD,等电点为5.75,在核苷酸和蛋白质水平上都与苹果上的抗黑星病基因家族Hcrvfs非常相似。Hcrp蛋白属于R基因编码的LRR-TM(亮氨酸重复序列-跨膜)型细胞外分泌型蛋白。生物信息学分析显示,该蛋白主要有28个由α螺旋和β折叠构成的亮氨酸重复序列(LRR),有多个蛋白质修饰和活化位点,三级结构为环状螺旋蛋白。
   2.利用同源克隆得到了四条Hcrp基因上游的候选序列,然后设计引物验证后得到了Hcrp基因的上游启动子序列,长907bp,生物信息学分析发现具有启动子所必需的各种元件,还有多种可能应答胁迫的元件,其中包括BIHD、DOF、GATABOX、GT1、WBOX、WRKY、MYB、MYC、SIFBOX、IBOX等。转录起始位点(TSS)很可能在翻译起始位点上游-39bp处。
   3.18个梨系统进化为四组,组Ⅰ(金秋梨、绿宇红、金川雪梨、硕丰、晚三吉)的Ka/Ks最高,为1.275>1,受到的正向选择最大,极显著高于Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组。四组之间的核苷酸多样性没有显著差异,而亮氨酸重复序列区域的变异较两端大。插入删除多态性中性测验显著,Tajima'sD=2.04978(p<0.05),白梨、砂梨、日本梨群体遗传差异小,三者之间有较强的基因交流。

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