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核盘菌病毒SsDRV的5'末端克隆及侵染性全长cDNA克隆的构建

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第一章文献综述

1真菌病毒的研究进展

1.1真菌病毒分类

1.2真菌病毒的传播

1.3真菌病毒与寄主真菌的互作

2核盘菌的研究进展

2.1核盘菌及其危害

2.2核盘菌的致病机理

2.3菌核病的防治

2.4核盘菌的弱毒现象

3盾壳霉的研究进展

3.1盾壳霉的概况

3.2盾壳霉的生防作用

3.3盾壳霉传播SsDRV的可能性

4本研究的目的及意义

第二章核盘菌SsDRV的cDNA侵染性载体的农杆菌介导转化盾壳霉

1材料和方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

2.1农杆菌介导转化盾壳霉ZS-1

2.2盾壳霉ZS-1转化子的鉴定

2.3盾壳霉ZS-1转化子的生物学特性分析

2.4盾壳霉ZS-1转化子的的RT-PCR和dsRNA检测

3小结与讨论

第三章核盘菌真菌病毒SsDRV基因组的5'末端克隆及序列分析

1材料和方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

2.1 dsRNA提取和总RNA提取

2.2 SsDRV的5’末端序列测定

2.3 SsDRV的dsRNA末端验证

2.4 SsDRV的末端结构分析

3小结与讨论

第四章核盘菌真菌病毒SsDRV的全长cDNA侵染性载体构建与转化

1材料和方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

2.1 SsDRV全长cDNA侵染性载体的鉴定

2.2核盘菌Ep-1PNA367转化子的验证

2.3核盘菌Ep-1PNA367转化子的生物学特性

2.4核盘菌Ep-1PNA367转化子的RT-PCR和dsRNA检测

3小结与讨论

参考文献

致谢

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摘要

本论文以核盘菌弱毒菌株Ep-1PN为材料,对核盘菌弱毒菌株Ep-1PN中的核盘菌衰退相关RNA病毒(SsDRV)的基因组序列进行了修正、构建了侵染性载体构建并对该载体进行了初步的验证。
   实验室前期构建的一个双元载体p1301-SsDRV,利用农杆菌介导转化技术转化盾壳霉。获得了105个转化子,PCR验证了T-DNA已成功导入到盾壳霉菌株ZS-1中。对转化子的菌落形态、菌丝生长速度、孢子产量、寄生致腐菌核等生物学特性进行了研究,结果表明导入SsDRV-cDNA未引起盾壳霉ZS-1出现显著的异常表型。采用RT-PCR可以检测到目的SsDRV-cDNA的mRNA,但未能检出dsRNA。通过对已知的SsDRV基因组进行分析,推测其5’末端序列可能存在未知的RNA片段。
   提取核盘菌弱毒菌株Ep-1PN的总RNA,采用SMART(Switching Mechanism At5’end of the RNA Transcript,SMART)技术克隆了SsDRV基因组的5’末端还存在82 nt的RNA片段。SsDRV基因组全长为5500个核苷酸序列(不包括polyA),只有一个开放式阅读框(174nt-5274nt)。SsDRV的5'末端含有一个帽子结构。进一步分析发现,SsDRV的基因组在5‘端存在着变异,其3’端含有polyA结构。对5’-UTR和3’-UTR进行二级结构预测,5’-UTR形成发夹结构,有一个AU富含区,3’-UTR形成类似tRNA结构。
   分段扩增SsDRV的cDNA,分别连入pUH18的构巢曲霉的trpC启动子下游和trpC终止子的上游,得到SsDRV的全长cDNA侵染性载体pTSVH。利用电穿孔转化核盘菌的原生质体,将线性化载体pTSVH导入核盘菌Ep-1PNA367的染色体中,获得了9个转化子。对转化子的生物学特性进行了分析,发现转化子生长缓慢且致病力减弱。通过PCR检测证实核盘菌菌株Ep-1PNA367中含有SsDRV的cDNA;RT-PCR检测表明SsDRV的cDNA的mRNA,但是采用纤维素CF-11法未检测到SsDRV的复制体形式dsRNA。

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