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一株产低温脂肪酶假单胞菌的筛选及产酶条件的优化

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华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书

1.前言

2.材料与方法

3.结果与分析

4.讨论

参考文献

致谢

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摘要

由于生物圈中超过80％的地方温度低于5℃，因而在生态学上低温环境比高温环境的影响范围更广。包括嗜冷菌和耐冷菌在内的低温微生物广泛分布于自然界中，目前所有研究过的低温自然环境如淡水、海水、海底沉积物、冰川、高山、南北极、深山洞以及人为低温环境如冷库、冷藏与冷冻食品中均存在着低温微生物，而且微生物的种类丰富多样。低温微生物所产的酶大多是低温酶。低温酶能在低温下有效发挥催化作用的特点，使其在生物工程领域有着广泛的应用前景。因此，对低温微生物的研究无论在理论上还是实践上都有重要意义。 本研究从来自华中农业大学的4处土样、长江流域武汉沿岸的6处土样、长江武汉流域的30处水样和广西桂林桃花江的45处水样中共计分离低温细菌25株。 产低温脂肪酶菌株在自然界中分布很广。油脂水解实验表明筛选得到25株低温细菌中有12株在10℃对油脂具有良好的分解效果，而在37℃分解油脂的能力很差。经初筛和摇瓶复筛确定一株产低温脂肪酶活力较高的菌株YT34-8作为进一步研究的出发菌株。 菌株YT34-8在LB培养基上15℃培养72 h的菌落白色、圆形、隆起、不透明、表面光滑、湿润、边缘波状，周围有透明晕圈，直径约5 mm。菌体革兰氏阴性、杆状、能运动。常规生理生化测试表明，菌株YT34-8兼性厌氧，生长不需要NaCl，最适生长温度28℃，4℃良好生长，37℃以上不生长，氧化酶反应阳性，接触酶反应阳性，明胶液化阳性，水解淀粉阴性，反硝化作用阳性，脂酶阳性，能利用葡萄糖、果糖。经过16S rRNA鉴定，与假单胞菌有98％的相似度。结合形态学、生理生化特征和16S rDNA序列分析结果，初步认定菌株YT34-8属于假单胞菌属，命名为Pseudomonas sp.YT34-8。 为了提高Pseudomonas sp.YT34-8的低温脂肪酶产生能力，对该菌的产酶条件进行了优化。首先结合单因素实验结果和文献报道，确定了11个影响假单胞菌发酵产脂肪酶的可能因素，然后采用Plackett-Burman法在这11个影响菌株脂肪酶发酵的因素中筛选出3个重要影响因素（橄榄油加入量、250 mL摇瓶装液量、摇瓶转速），最后用响应面分析法对这三个重要影响因素进行优化，确定了最适产酶条件，即：玉米浆，2％；豆饼粉，2.5％；蔗糖，1％；橄榄油，0.57％；MgSO<,4>·7H<,2>O，0.05％；K<,2>HPO<,4>，0.1％；，发酵温度，8℃；初始pH，7.0；发酵时间，48 h；250 mL摇瓶装液量，21 mL；摇瓶转速，182 r／min。在此条件下，其发酵液的酶活力可以达到7.833U／mL。 对Pseudomonas sp.YT34-8产脂肪酶的酶学性质进行了初步研究，得出其作用的最适pH为8.0，最适反应温度为30℃，在pH5.0-10.0范围内，30℃以下酶活力较稳定。

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