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抗真菌放线菌的分离和鉴定及抗稻瘟病病菌生物活性的研究

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由病原菌引起的植物病害是农业生产中发生普遍、危害严重的一类病害。本次研究从湖北省神农架周边地区，以不同海拔、不同土壤类型、不同生态环境以及周边典型代表植物为采集土样的标准，用传统的平板稀释法，在高氏1号培养基中加入K2Cr2O7作为杂菌抑制剂，分离所采集的土样中的放线菌。共分离得到800株放线菌。分别以植物病原真菌为指示菌，采用菌块法对322株放线菌进行筛选，确定有221株菌株具有至少抗一种真菌的生物活性。其中167株放线菌有抗稻瘟病病菌的生物活性，119株放线菌有抗棉黄萎病菌的生物活性，151株放线菌有抗立枯丝核菌的生物活性，125株放线菌有抗禾谷镰刀菌的生物活性，130株放线菌有抗葡萄灰霉病菌的生物活性。
　　 本试验分离出来的具有抗真菌活性强、抗菌谱广的放线菌中有两株菌株ⅡB21、ⅡR21具有抗很强的抗稻瘟病病菌的生物学活性，根据菌株的培养特征、形态学特征观察、16S rDNA序列及其系统发育树分析，初步确定菌株ⅡB21和菌株ⅡR21均为链霉菌属。摇瓶发酵结果表明，菌株ⅡB21和菌株ⅡR21的发酵液具有较强的抑制稻瘟病病菌生长的生物活性。为了提高抗菌活性物质的产量，对其发酵培养基以及发酵培养时间进行优化，菌丝体培养基为最佳发酵培养基，30℃、180rpm摇床培养为较佳发酵条件。
　　 采用杯碟法分别测定24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h、192h发酵液的抗稻瘟病病菌的生物活性，抑菌圈直径的数据表明，菌株ⅡB21、ⅡR21发酵液的次级代谢活性物质随发酵时间的延长而逐渐增加，并于120h时菌株ⅡB21、ⅡR21抑菌活性达最大值，抑菌圈直径分别为33.07mm、63.27mm，随后抑菌直径随抑菌时间的延长而减小，因此这两株菌株的最佳发酵时间以120h为宜。
　　 对菌株ⅡB21、ⅡR21活性物质的理化性质进行测定，分别取适量的发酵液滤液在4℃、室温、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃水浴锅中温度处理2h以及在立式高压灭菌锅内121℃的条件下分别处理20min、30min，待自然冷却至室温后分别用杯碟法测定其抑菌活性，结果表明30℃～70℃范围内处理的发酵液滤液的抗稻瘟病病菌的生物活性均没有明显变化，但当温度高于90℃时菌株ⅡB21、ⅡR21的发酵液滤液的抗稻瘟病病菌的生物活性明显降低，甚至丧失抗菌活性。
　　 用浓度为6.0mol/L HCl和6.0mol/L NaOH分别调节菌株ⅡB21、ⅡR21的原始发酵液滤液的酸碱度，使其最终的pH值分别为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0、9.0、10.0、11.0，4℃条件下处理过夜后，再分别将滤液的pH值依次调至原始发酵液滤液的pH值，研究表明活性物质在pH5.0～8.0范围内比较稳定，在强酸或强碱的条件下其抗菌活性明显减弱，甚至丧失抗菌活性。
　　 根据菌株ⅡB21、ⅡR21发酵液的活性物质在30℃～70℃、pH5.0～8.0范围内的稳定性，分别将其发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取，再用无水硫酸钠脱水过夜，再经旋转蒸发后得到活性物质的粗提物，用少量的丙酮溶解回收后放4℃保存备用。以正丁醇、乙酸、水(体积比为3：1：1)做展开剂系统，经薄层层析后(GF254)，样品在三用紫外分析仪(UV-254nm)下观察，菌株ⅡB21、ⅡR21发酵液粗提物样品都有荧光带，并且信号较强。

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