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鱼腥藻PCC7120cpcS2基因的初步研究与CpcS1和CpcT1抗体的制备

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藻胆蛋白是存在于蓝藻、红藻和隐藻中的一类同源蛋白家族，蓝藻藻胆蛋白生物合成的最后一步为色素与脱辅基蛋白的连接。藻胆色素的正确连接一般都需要特异的裂合酶来催化完成。在蓝藻Anabaena sp.PCC 7120中，CpcS1 作为藻胆蛋白裂合酶可催化CpcB中Cys-84 与藻蓝胆素(PCB)的连接。Zhao等通过同源性分析，在鱼腥蓝藻基因组中发现了与其同源性较高的编号为all5292的基因cpcS2，但研究显示其并不具备藻胆蛋白裂合酶活性，且其基因的表达受到氮剥夺条件的诱导。本研究利用分子克隆方法克隆了包含有同源臂的cpcS2基因片段，通过合适的酶切位点带入链霉素抗性基因后构建了重组整合载体pRL271-L-cpcS2-str-R 并转入到大肠杆菌HB101中，经三亲本杂交转化丝状鱼腥藻PCC 7120，用含壮观霉素的BG11 平板筛选得到了具有壮观霉素抗性的单交换重组藻株。对比野生藻，单交换重组藻的表型变化明显。同时，本实验利用克隆重组的原核表达载体pET-cpcS1、pET-cpcT1 在大肠杆菌中大量表达蛋白后，经粗分离和亲和柱层析提纯获得了大量可溶的重组融合CpcS1、CpcT1蛋白，用其分别免疫家兔后制备了两个蛋白的抗血清。免疫印迹结果表明原核表达的CpcS1、CpcT1蛋白具有较好的免疫原性，所制备的抗血清对CpcS1和CpcT1蛋白均有较高的免疫效价和特异性，但与CpcS2和CpcT2蛋白存在部分的免疫交叉反应。此外，本实验还对cpcS2基因的启动子进行了初步的分析。通过改造蓝藻穿梭质粒载体pHB912，插入绿色荧光蛋白gfp报告基因，构建了融合质粒穿梭载体pHB912-cpcS2P-gfpA 并转化鱼腥蓝藻PCC 7120。初步分析结果显示cpcS2基因起始密码子前539bp的DNA 片段不具备有起始cpcS2基因表达的功能。

著录项

作者
陈鹏;
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作者单位

中南民族大学;

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授予单位中南民族大学;
学科生物化学与分子生物学
授予学位硕士
导师姓名陈思礼;
年度 2009
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类植物基因工程;
关键词
鱼腥藻; 藻胆蛋白; 分子克隆; 编码基因;

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