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基于金属纳米材料的光学生物传感技术用于酶活性的检测

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摘要

第1章 绪论

1.1 生物传感器

1.1.1 生物传感器的组成及工作原理

1.1.2 生物传感器的分类

1.1.3 生物传感器的特点

1.1.4 生物传感器的应用

1.2 光学生物传感器

1.2.1 光学生物传感器的原理和特点

1.2.2 光学生物传感器的分类

1.2.3 基于酶的光学生物传感器

1.3 纳米材料

1.3.1 金纳米颗粒在生物传感器中的应用

1.3.2 金属纳米簇

1.4 本研究论文的构想

第2章 基于金纳米颗粒的凝集变色用于检测地衣芽孢杆菌蛋白酶

2.1 前言

2.2 实验部分

2.2.1 试剂与仪器

2.2.2 金纳米颗粒的制备

2.2.3 地衣芽孢杆菌蛋白酶的检测

2.3 结果与讨论

2.3.1 实验原理

2.3.2 蛋白酶与底物反应时间的优化

2.3.3 地衣芽孢杆菌蛋白酶的检测

2.3.4 选择性考察

2.4 小结

第3章 基于G增强荧光的DNA单链为模板合成的银纳米簇用于检测酶解底物胆固醇

3.1 前言

3.2 实验部分

3.2.1 试剂和仪器

3.2.2 G-DNA-Ag NCs的合成

3.2.3 H2O2对荧光的猝灭

3.2.4 胆固醇的检测

3.3 结果和讨论

3.3.1 本实验原理

3.3.2 在DNA链中添加G碱基的序列优化

3.3.3 H2O2对G-DNA-Ag NCs的荧光猝灭

3.3.4 对于猝灭机理的讨论

3.3.5 胆固醇的检测

3.3.6 胆固醇检测的选择性

3.4 小结

第4章 基于DNA双链为模板合成的铜纳米簇用于检测碱性磷酸酯酶

4.1 前言

4.2 实验部分

4.2.1 试剂与仪器

4.2.2 双链DNA模板的制备

4.2.3 PPi对Cu NCs合成抑制情况的研究

4.2.4 ALP的检测

4.3 结果和讨论

4.3.1 基于Cu NCs检测ALP的原理

4.3.2 PPi及Pi对Cu NCs合成的影响研究

4.3.3 实验条件优化

4.3.4 ALP浓度的检测

4.3.5 选择性考察

4.3.6 实际样的检测

4.4 小结

结论

参考文献

附录A 攻读硕士学位期间发表及完成的论文目录

致谢

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摘要

最近几年,随着纳米技术的发展,出现了各种各样的纳米材料,如金纳米颗粒、量子点、磁性纳米颗粒和金属纳米簇。由于它们独特的物理、化学、力学、磁性和光学特性,所以被成功应用于生物传感器中。基于纳米材料的生物传感器是材料科学、分子工程学、化学和生物技术的综合产物,它能极大地改善生物分子检测的灵敏性和特异性,可应用在许多方面,如生物分子识别、致病原诊断和环境监测等。本文将金纳米颗粒、银纳米簇和铜纳米簇这些新颖的金属纳米材料与光学转换器件结合,对地衣芽孢杆菌蛋白酶、胆固醇和碱性磷酸酯酶进行了灵敏的检测。具体内容包括:
   (1)基于金纳米颗粒的凝集变色特性开发了一种简便、快速的比色方法用于地衣芽孢杆菌蛋白酶的检测。在本文中,设计用于检测地衣芽孢杆菌蛋白酶的多肽底物两端含有半胱氨酸残基,中间含有两个能被目标蛋白酶特异性识别的D-亮氨酸残基。多肽底物两端半胱氨酸残基中的巯基可以与金纳米颗粒通过金-硫键的作用结合起来,引起金纳米颗粒的凝集,从而导致纳米金溶液颜色由红色变为蓝色;在目标蛋白酶地衣芽孢杆菌蛋白酶存在下,该蛋白酶通过识别D-亮氨酸残基将多肽底物切断,从而不会引起金纳米颗粒的凝集,溶液颜色仍为红色。该方法在0.1~5μg/mL地衣芽孢杆菌蛋白酶浓度范围内与A520/A600的吸光度比值呈线性关系,所得检测下限为0.09μg/mL。与传统的分析检测方法相比,该方法具有简单、快速、选择性高等优点。
   (2)基于3'端带有两个G碱基的DNA链为模板合成的具有荧光的银纳米簇(G-DNA-Ag NCs)发展了一种新颖的荧光检测方法用于酶解底物胆固醇的检测。此方法中,胆固醇在胆固醇氧化酶的作用下与溶解的氧气反应生成H2O2,利用所产生的H2O2的量对G-DNA-Ag NCs荧光信号猝灭的多少来间接检测胆固醇的含量。G-DNA-Ag NCs荧光信号的减少与胆固醇浓度的高低正相关,在线性检测范围为0.20~200μM时,此方法的检测限为0.15μM。我们设计的这一方法操作简单,其选择性很好。此外,这一方法对于能与氧化酶反应产生H2O2的其它底物提供了很好的平台,这一平台对于复杂生物学体系中氧化酶的检测提供了可能性。
   (3)基于双链DNA为模板合成了具有荧光的铜纳米簇(Cu NCs),发展了一种新颖的荧光无标记信号增强型检测碱性磷酸酯酶(ALP)活性的方法。该方法中,利用ALP的天然底物焦磷酸(PPi)与Cu2+之间的强烈相互作用,阻碍荧光Cu NCs的有效形成,从而导致荧光信号的降低。在目标分析物ALP存在时,由于其对PPi的水解,妨碍了PPi和Cu2+之间的螯合作用。然后,在双链DNA作为模板的条件下,通过抗坏血酸的还原,荧光Cu NCs有效的形成了,荧光强度也得到恢复,荧光的增强与ALP的浓度大小相关。当ALP浓度范围在0.1~2.5 nM时,此方法的检测下限为0.096 nM。该方法操作简便,无需任何化学标记,并且具有较高的灵敏度和选择性。此外,它也适用于复杂生物学体系中ALP的检测,对于与ALP相关疾病的生理学条件下的诊断有潜在的应用价值。

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