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【6h】

苏云金芽胞杆菌Cry51Aa1与PS4蛋白结构的比较与抗癌谱筛选

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目录

摘要

英文缩略词表1

英文缩略词表2

第一章 前言

1.1 选题背景

1.2.国内外有关本选题的研究动态和自己的见解

1.3 本课题的研究意义

第二章 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 生物资源及生化试剂

2.1.2 实验所需的仪器设备

2.1.3 主要溶液的配置

2.2 实验方法

2.2.1 Cry51Aa1的理化性质分析

2.2.2 Cry51Aa1与PS家族蛋白的聚类(分子进化)分析

2.2.3 Cry51Aa1与Parasporin-4结构的进一步比较

2.2.4 Cry51Aa1的表达与纯化

2.2.5 细胞培养

2.2.6 Cry51Aa1对细胞的活性作用测定

2.2.7 Cry51Aa1抗癌机理初步探索

第三章 结果

3.1 Cry51Aa1与PS蛋白聚类分析及结构比较

3.1.1 Cry51Aa1的理化性质

3.1.2 Cry51Aa1与已有PS蛋白的保守结构域

3.1.3 Cry51Aa1与PS蛋白氨基酸序列聚类分析结果

3.1.4 Cry51Aa1与Parasporin-4空间结构的进一步比较

3.2 蛋白表达与纯化

3.2.1 菌株活化,蛋白表达及鉴定

3.2.2 蛋白纯化及浓度测定

3.3 细胞活性测定实验

3.3.1 细胞形态学变化的观察

3.3.2 细胞存活率或细胞抑制率的结果分析

3.4 抗癌机理初步探索

3.4.1 细胞计数

3.4.2 FCM检测

3.4.3 WB检测

3.4.4 细胞划痕实验

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

综述 苏云金芽孢杆菌抗癌蛋白研究进展

致谢

攻读硕士学位期间的研究成果

声明

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摘要

目的:①比较苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)Cry51Aa1蛋白与具有毒杀癌细胞活性的Parasporin蛋白之间的进化关系及结构异同,由结构相似性推测目的蛋白Cry51Aa1蛋白可能具有的抗癌活性;②测试Cry51Aa1蛋白的抗癌活性及抗癌谱,筛选出1-2种敏感细胞株,并初步探讨Cry51Aa1对靶癌细胞发挥毒性作用的机制,为研究Cry51Aa1的功能提供新的生物学证据。
  方法:①采用生物信息学在线数据库分析Cry51Aa1的理化性质并调取其氨基酸序列信息,同时调取已报道的6类19种抗癌Parasporin蛋白序列,应用最大似然聚类法建立Cry51Aa1与PS家族的系统进化树图,找出可能与Cry51Aa1同源的PS蛋白;针对与Cry51Aa1序列相似度最高的PS蛋白,进一步比较两者在一级和二级结构中的各项参数,并以SWISS-MODEL进行同源建模,比较两者的三级空间结构,全面分析两者结构的异同。②纯化Cry51Aa1蛋白后,以18种细胞(包括12种人类肿瘤细胞,2种人类正常细胞,1种鼠肿瘤细胞,3种鼠正常细胞)作为受试对象,利用MTT实验初步筛选Cry51Aa1对各类细胞的细胞毒性作用,对敏感细胞株进一步分析时间和浓度因素对细胞生存率/抑制率的影响;③以流式细胞术(FCM)和免疫印迹实验(WB)探讨Cry51Aa1是否通过诱导细胞凋亡的方式发挥细胞毒性作用。
  结果:①通过氨基酸序列聚类建立的系统进化树图中,Cry51Aa1与PS4的氨基酸序列相似度最高,达到36%,自引导评估得boostrap值(自展值)>70,认为可信度较好。从结构比较中进一步体现了两者的结构相似性,两种蛋白模型在α-碳原子(Carboon alpha,CA)部分的结构差异均方根(RMS)=0.92。②Cry51Aa1易引起敏感靶细胞发生肿胀等形态学改变,细胞形态改变的程度与浓度梯度呈现一致性变化,随着作用时间的增加,肿胀的比例减少;③不同的细胞对Cry51Aa1的敏感性存在差异,肿瘤细胞敏感性高于正常细胞,且不同肿瘤系统的细胞对Cry51Aa1的敏感性存在差异,筛选到的Cry51Aa1抗癌谱包括消化系统的SGC-7901、GBC-SD与RBE,生殖系统的Hela、HEC、HBL-100、MDA-MB-231;④较高浓度的Cry51Aa1引起细胞发生凋亡,且初步认为,Caspase家族在Cry51Aa1引起的细胞凋亡中可能发挥了重要作用。
  结论:①Cry51Aa1蛋白可能与抗癌PS蛋白同源,且与PS4在氨基酸序列上亲缘关系最近,两者的结构相似性较高;②Cry51Aa1蛋白对多种人类肿瘤细胞具有细胞毒性,且敏感性存在差异。本次筛选到的抗癌谱包括消化系统3个细胞株和生殖系统4个细胞株,胃癌SGC-7901表现最为明显和稳定,但Cry51Aa1的特异性毒性还需经更大范围的抗癌谱验证;③Cry51Aa1引起细胞发生形态学和细胞活力的改变,且即细胞抑制率与蛋白浓度成存在剂量-反应关系,正比;④Cry51Aa1发挥细胞毒性可能是Caspase介导的细胞凋亡,且对细胞的迁移能力发挥一定的抑制作用。

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