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黄鳝和金鱼JNKs的分子克隆、组织特异性和发育分化表达模式研究

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黄鳝是一类在其生殖发育过程中雌性先熟的雌雄同体鱼类。其性逆转发生机制目前尚未掌握。为了探讨黄鳝性逆转的细胞和分子生物学机制，本文用经典的细胞组织化学方法对不同发育时期黄鳝生殖细胞进行了系统的分析，同时用生物化学和分子生物学的方法对黄鳝中三大丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的表达进行了全面的分析，其结果表明：
　　 (1)黄鳝生殖干细胞(GSCs)定位分布于生殖褶中，雌性发育阶段GSCs分散或成团存在，间性及雄性阶段GSCs均区分为A、B两种不同类型，雌性发育阶段GSCs与A、B两类GSCs在超微结构上存在差异。观察表明生殖褶中GSCs是黄鳝分化生殖腺中唯一具有有丝分裂能力的生殖细胞群，雌性发育阶段GSCs表现出卵原干细胞特征，间性及雄性发育阶段GSCs为精原干细胞。在对黄鳝性腺组织学结构检测中发现成熟精、卵巢结构同体存在，提出在黄鳝生殖腺发育中不排除雌雄同体成熟发生。
　　 (2)在黄鳝肝脏、肾脏、卵巢和精巢这四种组织中，ERK的表达水平达到最高，但在心脏和肌肉这两种组织中，ERK的表达明显降低。与蛋白水平相比较，ERK的活性(磷酸化)在肝脏和肾脏中为最高，而心脏和卵巢的ERK活性明显降低，精巢和肌肉组织中ERK的活性最低。与ERK相比较，JNK1/2的表达相对较低，其组织分布的情形是：在心脏、肾脏、肝脏、和卵巢中有较高水平的表达。在精巢和肌肉组织中，JNK2有明显的表达，但JNK1的表达水平比较难于解释。JNK1/2的活性(磷酸化)在正常生理状况下为阴性。p38蛋白激酶的表达和活性在以上六种组织中均未检测到。
　　 (3)对JNK1表达的进一步分析表明，在黄鳝雌性生殖腺中，JNK1 mRNA和蛋白质表达达到最高水平。随着黄鳝从雌性向间性时期转变，JNK1 mRNA和蛋白质表达水平显著下降。当黄鳝由间性发育到雄性阶段，JNK1 mRNA和蛋白质表达水平下降到难以检测的水平。由此可见，JNK1的下调表达与黄鳝由雌性向雄性转变过程密切相关。
　　 (4)克隆得到的黄鳝JNK1 cDNA(AB030900)全长为2191bp，包含阅读框1245bp，所编码的蛋白包由414个氨基酸组成。与黄鳝JNK1 cDNA相比，金鱼JNK1 cDNA(EU374209)全长序列为2016bp，包含阅读框1115bp，编码蛋白由385个氨基酸组成。
　　 (5)JNK1在金鱼各组织及胚胎发育过程中均有表达。JNK1在金鱼卵巢中的表达量显著高于精巢中的表达，这与黄鳝JNK1在性腺中的表达模式相似。在胚胎发育过程中，母体携带的JNK1 mRNA在原肠期明显下降，新的JNK1 mRNA的合成从神经胚开始逐渐增加，到脑泡期达到最高水平，这一水平一直维持到到眼色素期。此后逐渐下降，到出膜期JNK1 mRNA下降到与原肠期相同。通过使用反义寡聚核苷酸对斑马鱼体内JNK1基因表达的抑制，结果表明JNK1抑制对斑马鱼发育没有明显的表型影响。对性腺的发育是否有影响有待进一步研究。
　　 (6)克隆得到的金鱼JNH3 cDNA(FJ183484)全长为1794bp，包含的阅读框为1293bp，所编码的蛋白质由430个氨基酸组成。RT-PCR分析表明，JNK3只在金鱼脑组织和精巢中有特异表达。JNK3在精巢组织中的特异表达表明，它可能对精巢的发育有调控作用。胚胎发育过程中，JNK3从视原基开始出现，其后表达逐渐增加，出膜期达到最高水平。
　　 本文的结果表明，JNK1的表达与黄鳝的性逆转密切相关。JNK1下调所导致的下游基因出现的特定表达模式可能是黄鳝雄性性腺发育的基础。此外，JNK3也可能参与雄性性腺的发育调控。

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