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宠物大肠杆菌、耶尔森菌和空肠弯曲菌荧光偏振抗体检测方法的建立及初步应用

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当前，我国宠物数量逐年增多，随之而来的宠物疫病也不断增加，由此造成了公共卫生问题不容乐观。宠物大肠杆菌病、耶尔森菌病、空肠弯曲菌病等是目前比较常见的人兽共患细菌性传染病，临床症状主要是严重的腹泻。目前针对这3种宠物细菌性疾病的检测方法虽然对该病的诊断起到了重要作用，但普遍存在检测耗时长，步骤繁琐，假阳性率偏高等问题，这与快速检测方法“实时”、“快速”的要求相距甚远。因此，建立一种快速检测方法对于这3种细菌性疾病的监测防控具有重要意义。 荧光偏振检测法（Fluorescence Polarization Immunoassay Assay, FPIA）属于均相的免疫分析方法，具有简单、可靠、快速和高效的特点，可满足高通量、高速度、多残留和自动化的检测要求。 本研究以荧光素FITC标记产肠毒素大肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌和空肠弯曲菌的特异性蛋白，并以标记产物为示踪物建立一种新型荧光偏振免疫技术，从而达到简单灵敏且快速的检测效果。 主要研究内容和结果如下： 1、对产肠毒素大肠杆菌FaeG基因、小肠结肠炎耶尔森菌ail基因和空肠弯曲菌Peb1A基因进行原核表达，对重组蛋白进行鉴定，证明蛋白具有良好的免疫原性。 2、利用荧光素FITC在碱性条件下能与蛋白的胺基发生结合的特点，将FITC蛋白偶联形成示踪物FITC-FaeG、FITC-ail、FITC-Peb1A，通过荧光光谱鉴定及琼脂糖凝胶电泳对所形成的示踪物进行鉴定。 3、人工感染新西兰大白兔制备产肠毒素大肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌及空肠弯曲菌全菌多克隆抗体，利用间接 ELISA 法检测多克隆抗体效价，分别为1:64000、1:128000和1:102400。 4、对示踪物最佳反应时间、最佳反应浓度及血清最佳稀释度进行优化后，建立产肠毒素大肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌和空肠弯曲菌荧光偏振抗体检测方法，并对本方法各项指标进行评估，结果显示： （1）产肠毒素大肠杆菌荧光偏振抗体检测方法的最低检测效价为1:80，仅与产肠毒素大肠杆菌阳性血清发生特异性反应，但在其他阳性抗血清中无交叉反应，具有高度的特异性;批内批间变异系数为0.43%~3.47%和1.35%~4.68%，变异范围均小于10%，重复性较好。 （2）小肠结肠炎耶尔森菌荧光偏振抗体检测方法最低检测效价为1:120，具 有较强的特异性;批内批间变异系数为0.69%~3.81%和2.52%~6.47%，变异范围均小于10%，具有较好的重复性。 （3）空肠弯曲菌荧光偏振抗体检测方法最低检测效价为1:160，具有较强的特异性;批内批间变异系数为 0.69 %~3.81%和 2.52%~6.47%，变异范围均小于10%，具有较好的重复性。 5、本研究建立的三种抗体检测方法和相应的市售ELISA试剂盒同时对200份犬的临床血清样本进行检测，结果产肠毒素大肠杆菌总体符合率为95%;小肠结肠炎耶尔森菌总体符合率为93%;空肠弯曲菌总体符合率为89%。 综上所述，本研究通过对产肠毒素大肠杆菌FaeG基因、小肠结肠炎耶尔森菌ail基因和空肠弯曲菌Peb1A基因的原核表达，以及FITC对其进行标记形成示踪物，建立了产肠毒素大肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌和空肠弯曲菌荧光偏振抗体检测方法。本研究建立的方法具有较好的特异性、灵敏度及重复性，达到简单、灵敏且快速的检测效果，可应用于血清中抗体的快速检测，为宠物3种细菌性疾病的流行病学调查和监测提供技术和产品。

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