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结肠癌细胞系中p53调控癌干细胞表面标志物CD133表达及NU7026的辐射增敏作用研究

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第1章 绪 论

1.1 研究的背景

1.2 预实验探索性研究提示

第2章 材料与方法

2.1 材料

2.2 方法

2.3 细胞克隆形成实验

2.4 MTT实验

2.5 流式细胞术实验

2.6 免疫荧光激光共聚焦检测γH2AX foci

2.7 统计学方法

第3章 结 果

3.1 癌干细胞表面标志物CD133蛋白在两细胞系间的差异性

3.2 p53 对癌干细胞表面标志物CD133的调控

3.3 CD133启动子生物信息分析及报告基因重组载体

3.4 p53基因对CD133启动子转录活性的调节

3.5 HCT116细胞系癌干细胞特性

3.6 NU7026对HCT116细胞增殖的影响

3.7 流式细胞术分析

3.8 NU7026对放射诱发HCT116细胞DNA双链断裂损伤修复的影响

第4章 讨论

4.1 p53基因正向调控CD133启动子活性

4.2 DNA-PKcs抑制剂NU7026能增强结肠癌细胞系γ射线的敏感性

第5章 结 论

参考文献

综述: 以癌干细胞为靶的癌症治疗方法

附录

作者攻读学位期间的科研成果

致谢

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摘要

目的：以结肠癌细胞系HCT116为主要研究对象，探究p53基因是否调控癌干细胞表面标志物CD133的表达及作用机制，并研究DNA损伤响应调控蛋白DNA-PKcs的抑制剂NU7026对结肠癌干细胞的放射增敏作用。
　　方法：蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳免疫印迹杂交法（western blot），检测细胞系中相关蛋白的表达；以癌干细胞表面标志物CD133/CD44作为标记，通过流式细胞术分别检测p53野生型和p53突变型结肠癌细胞系中的癌干细胞亚群分布比例；实时定量RT-PCR（quantitative Real time-PCR）方法测定CD133和p53基因mRNA转录表达水平；通过瞬时基因转染的方法将shRNA表达质粒或p53基因真核表达质粒载体转染入细胞，构建干扰p53基因表达或者过表达p53基因的细胞模型；构建CD133启动子启动荧光素酶标记基因表达的重组质粒；用化学发光仪检测CD133启动子转录双荧光素酶活性。将含有高癌干细胞亚群比例的HCT116细胞系分成四个组：实验对照组，20
　　μmol/L NU7026作用组，2 Gyγ射线照射组，20μmol/L NU7026联合2 Gy辐射组，γ射线照射前2小时加入NU7026后，通过细胞克隆形成实验和MTT检测HCT116细胞增殖变化；流式细胞术检测细胞周期，细胞凋亡，癌干细胞亚群变化，免疫荧光激光共聚焦显微镜观察各组细胞并统计其?H2AX foci点均数等，分析评价NU7026对高癌干细胞亚基比例的结肠癌HCT116细胞系的放射增敏作用及其DNA双链断裂损伤修复反应的影响。
　　结果：首先通过western blot验证了p53野生型结肠癌细胞HCT116 p53+/+和p53突变型结肠癌细胞HCT116p53-/-的p53表达状态，确保了实验细胞模型的可靠性；CD133阳性亚群比例，在p53野生型细胞中高达84.84±0.05％，而在p53突变型细胞中只有4.13±0.02%；CD133基因mRNA转录表达检测结果显示，野生型细胞和突变型细胞的相对表达水平分别为0.16±0.041和0.0081±0.0039（t=6.29，P<0.01），表明不同p53状态的两HCT116细胞系之间癌干细胞表面标志物CD133的表达水平存在显著差异；在HCT116p53+/+中，通过siRNA干扰技术抑制p53蛋白表达后，CD133转录表达水平也随着下降，CD133阳性亚群比例也下降（从85.78±1.17%降至4.70±0.17%, t=119.79，P<0.0001）。抑制p53表达，CD133启动子的转录激活活性也显著下降；在HCT116p53-/-细胞系中过表达外源的p53蛋白，CD133转录表达水平也随之增加，为对照组的1.58倍。CD133启动子转录激活活性明显增加，且具有统计学意义。CD133亚群比例略增（从4.52±0.35%升至5.83±0.30%, t=4.92，P<0.01）；在293T细胞系中，分别转染p53过表质粒和p53干扰siRNA表达质粒，检测发现CD133启动子活性随p53蛋白的表达量增加而增加，或随p53蛋白表达抑制而减少。
　　在p53野生型结肠癌HCT116细胞试验中，20μmol/L NU7026+2 Gy组与单独2 Gyγ射线辐照组比较，显示出NU7026的放射增敏作用：细胞增殖慢，细胞克隆形成率明显下降（t=7.21，P<0.01），存活率降低更加显著（t=7.22，P<0.01）；照射后24小时G2/M期不可逆阻滞明显增加（t=7.67， P<0.01），在48小时，细胞早期凋亡率明显增加（t=8.24，P<0.05）；作为DNA双链断裂分子标记的细胞?H2AX foci的均数点明显增多；更为重要的是，单独照射后48 h， CD133阳性癌干细胞亚群比例还有所上升，提示癌干细胞更高的辐射抗性，而联合NU7026的处理组，CD133阳性癌干细胞亚群比例降低，有统计学意义。
　　结论：实验发现在结肠癌HCT116细胞中，p53正调控癌干细胞表面蛋白标记物CD133的表达，与对其启动子的转录激活作用有关。NU7026能降低癌细胞受?射线照射后的癌干细胞亚群比例，对癌干细胞为优势亚群的结肠癌HCT116细胞具有明显的放射增敏作用，增敏机制是多方面，包括抑制DNA修复、诱发不可逆G2/M期阻滞、增加细胞凋亡发生。

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