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AMPK活化在H2S拮抗阿霉素诱导大鼠H9c2心肌细胞凋亡中的作用

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摘要

研究背景与目的：
　　阿霉素是恶性肿瘤治疗的常用药，但其心肌毒性作用是导致肿瘤患者扩张型心肌病乃至心力衰竭的重要原因。阿霉素诱导的心肌细胞凋亡在其心肌毒性效应中扮演了重要角色。研究阿霉素心肌毒性的作用机制及其干预方法，对扩张型心肌病和心力衰竭的防治具有重要的理论与应用价值。硫化氢被认为是继一氧化氮和一氧化碳之后的第三个内源性气体信号分子。研究表明，硫化氢对心肌细胞具有保护作用。单磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK)不仅是细胞内能量传感器和调节器，也是细胞内的压力传感器。AMPK可通过调节活性氧/氧化还原反应平衡、细胞凋亡及细胞增殖等反应维持细胞内稳态。本研究以AMPK为切入点，旨在探讨硫化氢拮抗阿霉素诱导的H9c2心肌细胞凋亡的新作用机制。
　　方法：
　　采用MTT法检测H9c2心肌细胞活力；Hoechst33258染色后，荧光显微镜下观察H9c2心肌细胞核染色体形态改变；2,7-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)染色后，荧光显微镜检测 H9c2心肌细胞内 ROS水平，并采用 Image-Pro Plus软件半定量分析荧光强度平均值；Western Blot测定H9c2心肌细胞中p-AMPK、AMPK和p53蛋白的表达情况。
　　结果：
　　1.采用不同浓度的阿霉素（0、0.25、0.5、1、2、5μmol/L）处理 H9c2心肌细胞。细胞活力和细胞凋亡检测结果表明，阿霉素呈浓度依赖性降低细胞活力并促进细胞凋亡，本实验发现5μmol/L阿霉素诱导 H9c2心肌细胞凋亡最为明显。
　　2.选择不同浓度的NaHS（0、25、50、100、200μmol/L）预孵育H9c2心肌细胞30min后，再用阿霉素诱导H9c2心肌细胞凋亡。细胞活力和细胞凋亡检测结果显示，NaHS呈浓度依赖性拮抗阿霉素诱导 H9c2心肌细胞凋亡，以100μmol/LNaHS拮抗阿霉素诱导H9c2的心肌细胞凋亡最为明显。
　　3.细胞随机分为4组：对照组、5μmol/L DOX组、100μmol/L NaHS＋5μmol/L DOX组和5mmol/L PPG＋5μmol/L DOX组。测定H9c2心肌细胞中p-AMPK、AMPK和p53蛋白的表达及ROS水平，分析H2S含量的变化对阿霉素诱导H9c2心肌细胞凋亡的影响。结果显示，NaHS+DOX组p-AMPK/AMPK比值为DOX组的1.4倍（p＜0.05)，PPG+DOX组p-AMPK/AMPK比值较DOX组降低了40.7％（p＜0.05）；与DOX组相比，NaHS＋DOX组p53蛋白表达降低了51.4%（p＜0.05），而PPG＋DOX组p53蛋白表达增加了8.3%（p＜0.05）；与DOX组相比，NaHS+DOX组ROS水平降低了40%（p＜0.01），PPG+DOX组ROS水平升高了14.1%（p＜0.05）。提示H2S抗阿霉素诱导的H9c2心肌细胞凋亡可能与其活化AMPK和降低p53蛋白表达及ROS水平有关。
　　4.采用AMPK抑制剂compound C预先处理H9c2心肌细胞。细胞随机分为5组：对照组、5μmol/L DOX组、100μmol/L NaHS＋5μmol/L DOX组、10μmol/L compound C＋100μmol/L NaHS＋5μmol/L DOX组和10μmol/L compound C＋5μmol/L DOX组。分析AMPK被抑制后，H2S抗阿霉素诱导H9c2心肌细胞凋亡的作用是否有变化。结果表明，与NaHS+DOX组相比，compound C＋NaHS+DOX组p-AMPK/AMPK比值降低了25.8%（p＜0.05）。compound C＋NaHS+DOX组p53蛋白表达量、细胞ROS水平和细胞凋亡率分别为NaHS+DOX组的1.9倍（p＜0.05）、1.4倍（p＜0.05）和1.6倍（p＜0.05）。结果表明compound C抑制了H2S对阿霉素诱导H9c2心肌细胞中AMPK的活化作用以及对p53蛋白表达和ROS水平的降低作用。
　　结论：
　　H2S可拮抗阿霉素诱导的大鼠H9c2心肌细胞凋亡，其机制与活化AMPK，降低细胞内ROS水平和p53蛋白的表达有关。

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