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顺铂诱导导入外源性FHIT基因的宫颈癌SiHa细胞系细胞凋亡作用的实验研究

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引言

实 验 材 料

1. 主要仪器

2. 菌株、质粒和细胞

3. 药品及主要试剂

实验方法及步骤

1. 实验设计

2. 质粒扩增、提取、鉴定

3. 细胞传代与培养

4. 脂质体与电穿孔方法转染FHIT基因步骤及瞬时转染效果比较

5. Western blot检测外源性FHIT蛋白表达

6. 流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期

7. DDP处理细胞

8. 统计学处理

实 验 结 果

1. 重组质粒鉴定结果

2. 基因转染结果

3. Western Blot 鉴定结果

4. 转染细胞凋亡和细胞周期的流式检测结果

5.转染细胞DDP处理结果

讨论

结论

参考文献

致谢

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摘要

目的:验证外源性脆性组氨酸三联体(FHIT)抑癌基因的导入是否诱导宫颈癌SiHa细胞凋亡,观察FHIT导入与顺铂(DDP)联合应用诱导宫颈癌SiHa细胞凋亡的作用是否有协同效应,为联合基因治疗和化疗药物治疗人宫颈癌提供实验依据。
  方法:将重组质粒PRcCMV-FHIT(SiHa-FHIT组)及空质粒PRcCMV(SiHa-neo组)分别用脂质体和电穿孔方法转染无内源性 FHIT蛋白表达的SiHa细胞(未转染SiHa细胞为SiHa-C组),用PEGFP-C2质粒检测瞬时转染效率,蛋白质印迹(Western blot)法检测外源性FHIT蛋白表达情况,流式细胞术(FCM)分析转染细胞的凋亡及细胞周期。分别用0.5μg/ml、1.0μg/ml、2.0μg/ml浓度的DDP处理SiHa-FHIT组、SiHa-neo组、SiHa-C组细胞,通过噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖抑制率,吖啶橙-溴化乙啶(AO-EB)染色荧光显微镜观察凋亡细胞形态,FCM测定细胞凋亡率,比较DDP处理后各组细胞生长和凋亡程度的区别。
  结果:荧光显微镜下观察可见PEGFP-C2脂质体和电穿孔方法转染组的细胞的瞬时转染效率无明显区别(P﹥0.05),但两种方法在转染过程中对细胞形态的影响有差异。FCM检测SiHa-FHIT组、SiHa-neo组、SiHa-C组细胞的凋亡率分别为22.07%:4.86%:3.75%, SiHa-FHIT组细胞凋亡率显著升高(SiHa-FHIT组与SiHa-neo组、SiHa-C组相比P﹤0.05);细胞周期分析显示:SiHa-FHIT组G0/G1期细胞百分率(63.70%)较SiHa-C组(47.24%)增高。用不同浓度DDP处理各组细胞48小时后可见SiHa-FHIT+2.0μg/ml DDP组细胞增殖抑制更明显,细胞出现典型凋亡形态改变、凋亡率增高,与 SiHa-neo+2.0μg/ml DDP组、SiHa-C+2.0μg/ml DDP组比较差异有显著性(P﹤0.05),而用顺铂处理的SiHa-neo组与SiHa-C组之间差异无显著性(P﹥0.05)。
  结论:
  1.导入外源性FHIT抑癌基因的宫颈癌SiHa细胞存在FHIT蛋白的表达。
  2.FHIT蛋白的表达能诱导SiHa细胞凋亡。
  3.表达FHIT蛋白的SiHa细胞对DDP敏感性增加。

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