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中国人群别嘌呤醇致严重皮肤不良反应的遗传标志物研究

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摘要

缩略词

第一章 研究背景

第二章 方法与材料

2．1 研究路线设计

2．2 研究对象

2．3 主要试剂与试剂盒

2．4 实验方法及仪器

2．5 数据分析与统计

第三章 结果

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

综述 HLA与药物不良反应相关性遗传药理学方法研究进展

攻读学位期间主要的研究成果

致谢

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摘要

背景:别嘌呤醇在临床上广泛用于痛风、高尿酸血症及其并发症等的治疗。2004年首次有文献报道HLA-B*5801等位基因携带与中国台湾人群别嘌呤醇所致致死性严重皮肤不良反应(severe cutaneousadverse reaction，SCAR)强烈相关，该发现先后在欧洲、泰国、韩国、日本、葡萄牙、中国香港以及大陆人群中均得到验证。荟萃分析结果表明，中国人群中HLA-B*5801等位基因携带率尤其高，携带率约为8.9％。HLA分型由于技术、成本及基因本身的复杂性等原因而无法在实验室普及。近年来基于日本人群的GWAS研究发现与HLA-B相邻的PSORS1 C1基因内的单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism，SNP)rs9263726位点A等位基因与HLA-B*5801呈完全连锁不平衡，并在小样本人群建立了对该SNP位点进行分型的聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）法，提示rs9263726在日本人群可能作为别嘌呤醇导致SJS/TEN的替代分子标志物。中国人群中rs9263726是否可替代HLA-B*5801作为预测别嘌呤醇致严重过敏反应的预测因子目前没有相关的研究报道。焦磷酸测序(Pyrosequencing)是一种基于聚合原理的DNA测序方法，是新一代DNA序列分析技术，且分型方法准确、快速、简便、经济，易于在实验室普及用作SNP分型。
　　目的:在中国大陆人群中验证HLA-B*5801等位携带与别嘌呤醇致严重皮肤不良不良反应发生间的相关性;探索在中国人群中PSORS1C1 rs9263726(G＞A)A等位基因替代HLA-B*5801作为预测别嘌呤醇致严重皮肤过敏反应发生的分子标记物的可行性;建立可用于对rs9263726位点进行分型的焦磷酸测序法。
　　方法:通过多中心回顾性病例-对照研究，收集了来自全国各地17家医院别嘌呤醇致严重皮肤不良反应患者血液标本92例，同时在广州、广西、四川、湖南和山西等地收集连续或累计服用别嘌呤醇3个月以上未出现皮肤不良反应（别嘌呤醇耐受组病例）的患者血液标本81例，收集长沙地区健康志愿者外周血标本99例。提取DNA后通过直接测序分型法(sequencing based typing，SBT)对所有标本进行进行HLA-B基因分型。Sanger测序法分型对三组人群的PSORS1 C1rs9263726(G＞A)位点进行分型，计算HLA-B*5801和rs9263726(G＞A)位点间的连锁不平衡强度参数D'和r2;通过设计PCR扩增引物和生物素标记的测序引物，建立可用于对rs9263726位点进行分型的焦磷酸测序分型方法。
　　结果:本研究收集到92例出现别嘌呤醇所致SCAR的患者，SCAR的具体类型包括伴嗜酸性粒细胞增多性全身症状的药物反应(Drugreaction with eosinophilia and systemic symptoms，DRESS)、史蒂文斯-约翰逊综合征(Stevens-Johnson syndrome，SJS)和中毒性表皮坏死松解症（Toxic epidermal necrolysis，TEN）。在92例DRESS/SJS/TEN患者中，有87例患者(87/92，94.57％)携带HLA-B*5801等位基因，别嘌呤醇耐受组患者中该等位基因的携带率为11.11％(9/81)，HLA-B*5801携带增加别嘌呤醇至严重皮肤不良反应发生风险的比值比(odds ratio, OR=139.2,95％CI:44.7-433.9, p=3.02×1028)。84例(91.30％)出现别嘌呤醇所致DRESS/SJS/TEN的患者携带rs9263726 A等位基因，而别嘌呤醇耐受组人群中rs9263726 A等位基因的携带率为11.11％，以rs9263726多态性位点预测别嘌呤醇致严重皮肤不良反应的比值比(OR)为84.0(95％ CI:30.8-229.0，p=4.75×10-26)。99名健康志愿者中rs9263726 A等位基因携带者的频率为14.14％。HLA-B*5801和PSORS1C1 rs9263726(G＞A)多态位点间呈强连锁不平衡(D'=0.966，r2=0.902)。HLA-B*5801用于预测该人群别嘌呤醇SCAR发生的灵敏度和特异度分别为94.57％和88.89％;阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)分别为90.61％和93.51％; rs9263726(G＞A)多态位点A等位基因用于预测该人群别嘌呤醇致SCAR发生的灵敏度和特异度分别为91.30％和88.89％;PPV和NPV分别为90.32％和90.00％。将携带HLA-B*5801和rs9263726 A等位基因作为诊断指标分析ROC曲线下面积AUC分别为0.911和0.895。本研究所建立的rs9263726(G＞A)位点焦磷酸测序分型方法与Sanger测序法所得基因型的一致率达100％。
　　结论:1）证实在中国大陆人群中HLA-B*5801等位基因携带与别嘌呤醇所致严重不良反应（SJS/TEN/DRESS）的发生风险强相关;2)中国人群中HLA-B*5801与PSORS1C1 rs9263726 A等位基因呈高度连锁不平衡，rs9263726 A等位基因可作为在中国人群中预测别嘌呤醇所致SCAR风险的替代分子遗传标志物;3）建立了可用于对rs9263726多态性位点用于分型的焦磷酸测序方法，可用于在应用别嘌呤醇前对严重皮肤过敏反应的发生进行预测，指导个体化用药。

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