核仁蛋白PICT-1在核糖体应激下对MDM2-P53信号通路及肿瘤细胞生长的影响及其分子机制

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第一章PICT-1是一个与MDM2酸性结构域结合的核仁蛋白，PICT-1作为MDM2的E3泛素化底物在外源性核糖体应激下通过泛素-蛋白酶体途径被降解
　　目的:筛选新的能与鼠双微基因2(The murine double minute，MDM2)酸性结构域结合的蛋白质，以进一步明确该结构域在MDM2对P53负性调节中的作用机制，同时探索MDM2与第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因(phosphatase and tensin homologdeleted on chromosome ten，PTEN)羧基末端结合蛋白-l(Proteininteracting with PTEN carboxy terminus-1，PICT-1)的相互作用关系。
　　方法:应用酵母双杂交系统，以MDM2的酸性结构域为诱饵，筛选人脑cDNA文库，探索能与之结合的蛋白，应用免疫共沉淀技术对候选蛋白质PICT-1与MDM2结合的能力进行确认;核苷酸分析软件对PICT-1功能区进行分析;westem blotting技术用于比较PICT-1蛋白在不同组织来源的正常细胞和癌细胞中的表达差异;免疫荧光及western blotting技术探索PICT-1蛋白对于各种放化疗药物的应答反应并分析外源性核糖体应激条件下PICT-1蛋白被降解的分子生物学特征。用泛素化失活的MDM2 C464A点突变质粒转染肺癌细胞及采用MDM2和P53双敲除的鼠成纤维细胞研究MDM2蛋白E3泛素化活性在PICT-1降解过程中所起的作用。
　　结果:包括PICT-1在内的20种蛋白质在酵母双杂交系统中能与MDM2的酸性结构域结合，PICT-1与MDM2结合的能力被免疫共沉淀实验所证实，PICT-1蛋白从氨基酸147至羧基尾端为与MDM2酸性结构域结合的区域。PICT-1是一个具有典型PEST结构的细胞核仁内蛋白质，在肺癌、乳腺癌、前列腺癌细胞中PICT-1蛋白表达量较正常细胞为低。在外源性核糖体应激条件下:一，PICT-1从核仁中位移至细胞核，表现为时间和剂量依赖性的降解，这种降解可被蛋白酶体途径抑制剂MG132所阻断;二，MDM2泛素化失活的C464A点突变能使PICT-1的这种降解作用消失;三，PICT-1在野生型鼠成纤维细胞中被降解，却不能在MDM2和P53双敲除的鼠成纤维细胞中被降解。
　　结论:
　　 (1) PICT-1是一个能与MDM2酸性结构域结合的核仁内蛋白质;
　　 (2) PICT-l作为MDM2泛素化底物在外源性核糖体应激条件下通过泛素-蛋白酶体途径被特异性降解。
　　第二章过表达PICT-1对癌细胞生长影响及其机制研究
　　目的:研究过表达PICT-1对癌细胞生长影响及其机制。
　　方法:采用细胞克隆集成能力及生长曲线方法研究过表达PICT-1蛋白对非小细胞肺癌细胞及其他癌细胞生长的影响，采用免疫荧光及western blotting研究过表达PICT-1蛋白对癌细胞生长影响的作用机制。
　　结果:过表达PICT-1可抑制非小细胞肺癌细胞A549(P53wt&pten wt)及及乳腺癌细胞MCF7(P53 wt&pten wt)的生长，但在非小细胞肺癌细胞H1299(P53 null& pten mutant)、骨肉瘤细胞U20S（P53 wt&pten null）及前列腺癌细胞PC3(P53 null& pten null)中表现不明显，PICT-1过表达可通过抑制MDM2对P53的E3泛素化连接酶活性，继而稳定并激活P53蛋白。无论在有无P53的情况下，PICT-1蛋白过表达均能通过其羧基端稳定MDM2，提示这种稳定作用是P53转录活性非依赖性的。同时PICT-1可诱导MDM2从细胞核分布至细胞核仁中，使其失去与P53蛋白的作用机会。过表达PICT-l使抑癌蛋白ARF的半衰期由6小时延长为10小时。PICT-1蛋白过表达可稳定PTEN蛋白;在外源性核糖体应激的条件下，同时过表达PTEN和PICT-1，二者可共同定位于细胞核中。
　　结论:
　　 (1)过表达PICT-1通过抑制MDM2对P53蛋白的泛素化连接酶活性，稳定并激活P53蛋白，抑制非小细胞肺癌A549细胞及乳腺癌MCF7细胞生长
　　 (2)过表达PICT-1还可以诱导MDM2分布至细胞核仁，延长ARF的半衰期，增强PTEN蛋白稳定性，是一个功能多样的抑癌蛋白。
　　 (3)过表达PICT-1对癌细胞生长抑制作用在不同细胞中表现不同，可能与P53及PTEN等蛋白表达状态密切相关。
　　第三章慢病毒介导的PICT-1沉默抑制癌细胞生长机制研究
　　目的:探讨慢病毒介导的PICT-1沉默对癌细胞生长的影响并阐明其作用机制。
　　方法:采用两个不同靶序列构建慢病毒shRNA载体特异性沉默PICT-1，并以鼠源PICT-1挽救实验确认其特异性。以sh GFP为阴性对照，RT-PCR检测PICT-1、P53及PTEN mRNA表达水平，Western blot检测MDM2、P53、P21、B23及PTEN及磷酸化AKT蛋白含量，Western blot检测MDM2半衰期变化及外源性核糖体应激下同时沉默PICT-1时MDM2、P53、P21蛋白含量，luciferase assay检测各个分子信号通路活性，免疫荧光法检测B23蛋白分布变化及核仁结构改变，免疫荧光法检测PTEN蛋白在内源性沉默PICT-1及外源性核糖体应激下的细胞内分布改变。生长曲线及细胞集落形成实验检测PICT-1沉默后或外源性核糖体应激下同时沉默PICT-1后细胞增殖生长能力，并计数行定量统计学分析，流式细胞学用于细胞周期分析;划痕实验用于PICT-1沉默后癌细胞侵袭性比较。
　　结果:PICT-1沉默特异性高，其造成的细胞生长抑制效果可被鼠源PICT-1表达后所“挽救”。与sh GFP阴性对照比较，PICT-1沉默组:使B23蛋白弥散分布于细胞核，且核仁结构完整性受到破坏;luciferase assay显示P53信号通路被激活;P53及PTENmRNA无明显变化;P53、MDM2、P21、磷酸化AKT蛋白上调，PTEN及B23蛋白下调;MDM2蛋白半衰期从0.5小时延长为2小时;与sh GFP阴性对照组比较，PICT-1沉默使细胞生长减慢，集落形成能力下降(P＜0.05或P＜0.01)，细胞周期部分阻滞于G0/G1期;但划痕实验显示细胞的侵袭能力却增强;在外源性核糖体应激作用下，沉默PICT-1后细胞生长快于阴性对照(P＜0.05或P＜0.01)。
　　结论:
　　 (1) PICT-1沉默破坏了核仁结构，引起内源性核糖体应激;
　　 (2) PICT-1沉默稳定MDM2及P53蛋白，并激活P53，引起细胞周期阻滞，细胞生长受到抑制;
　　 (3) PICT-1沉默可抑制低浓度放线菌素D对P53的激活。

著录项

作者
宋珑;
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作者单位

中南大学;

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授予单位中南大学;
学科外科学
授予学位博士
导师姓名胡建国;
年度 2011
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类治疗实验;
关键词
核仁蛋白沉默; 细胞周期; 内源性核糖体应激; p53活化; 分子机制; 细胞生长;

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