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pcDNA3.1(-)/MAGE-3-HSP70壳聚糖纳米粒的制备及抗肿瘤免疫效应研究

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恶性肿瘤一直严重威胁着人类的健康和生命，传统的治疗方法不尽如人意。肿瘤疫苗利用肿瘤抗原诱导机体的抗肿瘤免疫应答，以调节机体免疫功能，达到治疗肿瘤的目的，被认为是最具前景的肿瘤治疗方法。肿瘤疫苗包括肿瘤细胞瘤苗、DC瘤苗、抗原肽疫苗、蛋白疫苗，核酸疫苗等。
　　 核酸疫苗，主要是指DNA疫苗，具有安全、免疫原性低、制备和储存方便可诱导细胞免疫应答等优点，因而成为肿瘤特异性免疫治疗中一种极具吸引力的新型疫苗。但DNA疫苗诱导的免疫应答水平不够高，因此如何构建高效的抗肿瘤DNA疫苗已成为肿瘤免疫治疗研究中的热点。
　　 肿瘤特异性免疫治疗的关键是发现并鉴定肿瘤特异性抗原。黑色素瘤抗原(Melanoma Antigen，MAGE)是首个被报道的人类肿瘤特异性抗原，MAGE-3是MAGE家族成员之一，广泛表达于多种恶性肿瘤，而在除睾丸和胎盘外的正常组织中均不表达，是肿瘤特异性免疫治疗理想的靶分子。虽然以MAGE-3为抗原的肿瘤疫苗可以诱导MAGE-3特异性CTLs的产生，仍需提高疫苗的免疫原性以提高疫苗效能。热休克蛋白(Heat Shock Proteins HSPs)是生物体在不良环境因素作用下产生的具有高度保守性的应激蛋白，其参与蛋白质的转位，折叠与装配以及在抗原的加工递呈过程中起着重要作用，因此其也被称为“分子伴侣”。近年来研究发现，热休克蛋白具有抗原递呈功能，能将肿瘤细胞内的抗原信息传递至细胞膜上，进而诱导机体产生特异性抗肿瘤免疫应答，从肿瘤组织中提取的HSP-肽复合物能诱导抗肿瘤免疫应答，体外构建的HSP-肽复合物具有同样的作用并且其诱导的免疫应答可不受MHC限制，故以HSPs为基础的肿瘤疫苗是目前肿瘤疫苗研究中的热点。
　　 目前基因递送载体有两类，分为病毒型和非病毒型基因递送系统，病毒型基因递送系统转染率较高，却也有很多不足之处，例如具有致癌效应和免疫原性。而阳离子聚合物如壳聚糖可与DNA结合作为非病毒型递送载体。壳聚糖是生物可降解性天然多糖，其生物相容性好并能保护DNA不被核糖核酸酶降解，故而在基因传递方面展现巨大潜力。
　　 本实验构建了真核表达质粒pcDNA3.1(-)/MAGE-3-HSP70，并采用复凝聚法制备了pcDN.A3.1(-)/MAGE-3-HSP70壳聚糖纳米粒。检测其抗肿瘤免疫反应，并利用小鼠肿瘤模型观察其对表达MAGE-3抗原肿瘤的治疗作用。
　　 目的：构建黑色素瘤抗原-3(MAGE-3)、人热休克蛋白70(HSP70)融合基因的真核表达载体。方法：设计含Xho I酶切位点MAGE-3引物及含Kpn I酶切位点HSP70引物，以pINCY/MAGE-3和pOTB7/HSP70为模板扩增MAGE-3和HSP70基因片段，以基因片段为模板，采用MAGE-3上游引物(含Xho I酶切位点)及HSP70下游引物(含Kpn I酶切位点)，PCR扩增MAGE-3-HSP70融合基因片段，Kpn I和Xho I双酶切并连接至pcDNA3.1(-)，转化感受态大肠杆菌DH5α，获得阳性克隆进行双酶切和测序鉴定。结果：测序结果显示MAGE-3与Gene Bank上公布的序列完全一致,HSP70有三处同义突变。结论：成功构建MAGE-3-HSP70融合基因真核表达载体。
　　 目的：采用复凝聚法制备包裹pcDNA3.1(-)/MAGE-3-HSP70壳聚糖纳米粒，观察研究其相关特性。方法：采用复凝聚法制备包裹pcDNA3.1(-)/MAGE-3-HSP70壳聚糖纳米粒，将壳聚糖基因纳米粒转染B16细胞，利用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测体外转染效果；应用噻唑蓝(MTT)评价壳聚糖基因纳米粒子的体外细胞毒性。结果：壳聚糖基因纳米粒的平均粒径约为223 nm,Zeta电位为16mV；DNA包封率为92.3％，B16细胞转染实验显示其效率与Lipofectamine2000相近，而其毒性远低于Lipofectamine2000。结论：壳聚糖纳米粒子可高效装载质粒DNA转染B16细胞，而且对细胞基本无毒。
　　 目的：检测pcDNA3.1(-)/MAGE-3-HSP70壳聚糖纳米粒体内免疫学效应及抑瘤效应。方法：DNA疫苗免疫C57BL/6小鼠，ELISPOT，LDH释放实验、ELISA等检测其对小鼠细胞和体液免疫的作用，观察疫苗对B16-MAGE-3肿瘤的治疗作用。结果：DNA疫苗免疫小鼠后，与其他组比较，pcDNA3.1(-)/MAGE-3-HSP70壳聚糖纳米粒组脾淋巴细胞中分泌IFN-γ的T细胞数量显著增多，CTLs对B16-MAGE-3的特异性杀伤作用显著增强;但各组血清抗MAGE-3抗体水平没有明显差异；pcDNA3.1(-)/MAGE.3-HSP70壳聚糖纳米粒组B16-MAGE-3肿瘤体积显著小于其它组，荷瘤小鼠生存期显著长于其它组；结论：pcDNA3.1(-)/MAGE-3-HSP70壳聚糖纳米粒能够增强表达MAGE-3肿瘤的特异性的细胞免疫，对表达MACE-3的肿瘤有良好的治疗作用，效果较裸DNA疫苗要好。

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