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全反式视黄酸诱导新生大鼠视网膜神经前体细胞向光感受器细胞分化的研究

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前言

第二章材料与方法

2.1实验动物

2.2材料及器械

2.3实验试剂

2.4实验方法

第三章实验结果

3.1视网膜神经前体细胞的体外培养与鉴定

3.2 0.5μM ATRA、10％胎牛血清的诱导分化作用

第四章讨论

4.1外源性有丝分裂原的作用

4.2诱导分化结果分析

第五章结论

参考文献

综 述:视网膜干细胞培养及移植研究进展

致谢

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摘要

目的：探讨全反式视黄酸（all-trans retinoic acid，ATRA）诱导新生大鼠视网膜神经前体细胞（neural retinal progenitor cell，NRPC）向光感受器细胞分化的作用。 方法：从新生Sprague-Dawley大鼠（出生后第一天，day1 postnatal，P1）视网膜分离并扩增视网膜神经前体细胞（retinal progenitor cells，RPC），在含968μl/m1N2、10μl/m1827、20ng/ml表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、20ng/ml碱性成纤维生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、2μg/ml肝素及1％青链霉素的无血清DMEM/F12完全培养基中培养和传代。取第3代视网膜神经前体细胞作为研究对象，随机分为三组：①RPC对照组：继续原完全培养基培养；②胎牛血清诱导组：在原完全培养基中去除EGF、bFGF和肝素并加入10％胎牛血清；③全反式视黄酸（ATRA）诱导组：在原完全培养基中去除EGF、bFGF和肝素并加入1％胎牛血清及0.5μmol/L全反式视黄酸诱导分化。孵育七天后观察细胞形态变化，采用免疫细胞化学法检测神经干/前体细胞的标记物巢蛋白Nestin、神经胶质细胞的标记物胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）、神经元标记物β-微管蛋白（β-Tubulin）、光感受器细胞不同发育阶段的标记物视锥-视杆细胞同源异型基因（cone-rod homeobox gene，CRX）、恢复蛋白Recoverin及视紫红质Rhodopsin的表达，分别比较三组间各种标记物表达的阳性率。采用逆转录聚合酶链式反应（reverse-transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）检测三组细胞中成对同源异形盒转录因子6（paired box6，Pax6）mRNA的表达含量，分析全反式视黄酸对视网膜神经前体细胞向光感受器细胞分化的诱导效应。 结果： 1.视网膜神经前体细胞诱导分化后的免疫荧光鉴定结果： ①对照组：在未经诱导的对照组，细胞多呈集落生长，少部分单个贴壁，形态以椭圆形或三角形为主，有两到三个短的突起，胞核较大，呈圆形，胞质较少，79.5％细胞为Nestin阳性表达细胞，即神经前体细胞；GFAP、β-Tubulin、CRX、Recoverin及Rhodopsin阳性表达细胞百分比分别为15.8％、13.4％、10.9％、10.1％和8.9％。 ②胎牛血清诱导组：视网膜神经前体细胞经10％FBS诱导7天后，光镜下见细胞呈单个贴壁生长，部分细胞胞体扁平，形态不规则，似胶质细胞。部分细胞伸出一个或多个突起，突起与突起相接触。Nestin阳性表达细胞数目明显减少，而GFAP阳性表达细胞数目显著增加，β-Tubulin、CRX、Recoverin及Rhodopsin阳性表达的细胞数量明显增加，有显著差异（P<0.05）。其中Nestin、GFAP、β-Tubulin、CRX、Recoverin及Rhodopsin阳性表达细胞百分比分别为16.0％、70.9％、21.2％、18.8％、18.7％和17.9％。 ③ATRA诱导组：视网膜神经前体细胞经0.5μM全反式视黄酸诱导7天后，细胞呈单个贴壁生长，部分细胞伸出一个或两个较长突起，突起间互相接触。β-Tubulin、CRX、Recoverin及Rhodopsin阳性表达的细胞数量明显增加，有显著性差异（P<0.05）。Nestin、GFAP、β-Tubulin、CRX、Recoverin及Rhodopsin阳性表达细胞百分比分别为14.1％、23.2％、64.7％、61.2％、59.2％和55.4％。 对照组大部分细胞仍然表达nestin，而胎牛血清组和ATRA组nestin阳性表达细胞数量显著减少（P<0.05）；胎牛血清组GFAP阳性表达细胞数量显著增多（P<0.05），是对照组的4.49倍；ATRA组早期神经元β-Tubulin阳性细胞明显增多（P<0.05），是对照组的4.83倍。ATRA组的光感受器标记CRX、Recoverin及Rhodopsin阳性表达细胞分别为对照组的5.61、5.86和6.22倍。 2.PAX6 mRNA的表达：视网膜神经前体细胞诱导分化后，凝胶电泳图分析检测发现：ATRA诱导组PAX6表达量最少，胎牛血清组其次，对照组Pax6表达量最多。 结论： 0.5μM全反式视黄酸在体外能有效诱导新生SD大鼠视网膜神经前体细胞向神经元细胞包括光感受器细胞方向分化。

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