Na/牛磺胆盐共转运体（NTCP）和顶端钠依赖性胆盐转运体（ASBT）遗传药理学研究

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研究背景：肝脏中合成的胆汁对于肠道吸收，消化脂类物质，以及胆固醇代谢平衡至关重要。胆汁从肝脏分泌后储存在胆囊中，食物刺激后，排入十二指肠和小肠，在回肠末端，大部分胆汁被肠壁吸收，经门静脉回流到肝脏，被肝细胞重摄取后供再次分泌，胆汁每天经过数次肝肠循环，这一过程和肝脏和肠道上分布的一系列转运体密切相关，其中最主要的是两个solute carrier 10A家族(SLC10A)成员：表达在肝细胞基底膜的Na<'+>/牛磺胆盐共转运体(NTCP，SLC10A1)和表达在回肠壁腔侧膜上的顶膜钠依赖性胆盐转运体(ASBT，SLC10A2)。NTCP负责降门静脉血中的胆盐摄取回肝细胞，而ASBT则负责小肠对胆盐的重吸收。基因遗传多态性是蛋白质功能变异和个体差异的一个主要来源，可以预计NTCP和ASBT基因多态性可以造成转运体功能改变，进而影响胆汁的肝肠循环。负责肠道中胆盐的重吸收的ASBT转运体抑制后，肠道胆盐丢失增加，肝脏通过增加代谢胆固醇产生胆酸来代偿，因此ASBT抑制药可以模拟和胆盐螯合剂(如胆盐结合树脂)类似的机制降低胆固醇，这在动物实验中得到了证实。因此ASBT可以作为降脂药物开发的新靶点。本研究从400个中药提取物中筛选ASBT转运体抑制剂。方法：(1)我们对50个韩国人DNA样本的SLC10A1和SLC10A2基因外显子和启动子区进行测序。对发现的新的编码区非同义突变，在韩国、中国和越南人大样本中用pyrosequencing方法进行基因分型。随后在转染的MDCK细胞和爪蟾卵母细胞模型上，以[<'3>H]牛磺胆酸和[<'3>H]雌酮为底物检测NTCP蛋白野生型和两个突变型的摄取功能，同时观察已知的NTCP抑制药牛磺胆酸、碘溴酞钠和环孢霉素A对NTCP野生和突变型摄取标记底物的影响。 (2)将稳定转染ASBT的MDCK细胞株，接种到96孔板，以[<'3>H]牛磺胆酸为底物，观察多种中药乙醇提取物对ASBT转运体摄取活性的影响。MTT法测定中药提取物对细胞有无毒性作用。结果：(1)我们在SLC10A1基因编码区发现4个SNP，分别是1号外显子的G18A、G190A和G225A突变和4号外显子C800T(*2)突变。其中G190A是一个新的非同义突变，G190A突变导致64位丙氨酸变为苏氨酸，C800T突变导致267位丝氨酸转变为苯丙氨酸。G190A在150名韩国人样本中发现3个杂合子(等位基因频率为1％)，而在366个中国汉族人样本和152个越南Viet Kinh族人中未发现该突变。对于*2突变，在韩国人、中国人和越南人中等位基因频率分别为3.1％、7.4％和9.2％。在SLC10A2编码区发现3个SNP：G429C、G501T和G990A，其中G501T突变导致171位丙氨酸变为丝氨酸，此外我们还在基因内含子和上游启动子区发现多个SNP，但没有发现编码区新的突变。 (2)C800T(Ser267Phe)突变使NTCP对[<'3>H]牛磺胆酸的摄取能力几乎完全丧失，但仍保持正常的摄取[<'3>H]雌酮的能力，而G190A(A1a64Thr)突变，使NTCP摄取[<'3>H]牛磺胆酸的能力大大减弱，而对[<'3>H]雌酮没有摄取功能。三种已知抑制剂牛磺胆酸、碘溴酞钠和环孢霉素A可以有效抑制NTCP野生型和两个突变体对同位素标记底物的摄取。RT-PCR证实G190A和C800T突变并不影响基因在转染细胞中的mRNA表达量。此外爪蟾卵母细胞模型上，和注射野生型NTCP cRNA的细胞相比，注射NTCP(C800T)cRNA的卵母细胞没有摄取[<'3>H]牛磺胆酸的活性，而注射了NTCP(G190A)cRNA的卵母细胞摄取[<'3>H]牛磺胆酸的能力也大大减低。 (3)从400个中药提取物中，我们筛选出24个对ASBT转运体摄取功能抑制效应较大的，并做了剂量依赖性抑制实验计算其IC50。这些中药中，有些如茯苓，其主要成分和胆酸的结构类似，另外一些如甘草皂苷类本身有降胆固醇效应。根据IC50的高低以及参考这些中药的临床药理作用，我们最后选取了其中的4种，MTT法发现这些中药提取物培养48小时，对细胞无毒性作用，为后续动物实验提供基础。结论：(1)我们在韩国人中发现SLC10A1基因新的非同义突变G190A(A1a64Thr)，该突变在中国汉族人和越南Viet Kinh人中没有找到。该突变在细胞水平摄取牛磺胆盐和硫酸雌酮的能力大大减弱。(2)在96孔板体外细胞摄取实验平台上，我们从400种中药提取物中筛选出若干种ASBT抑制剂，这些物质降胆固醇效应将通过动物实验来验证。

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作者
潘玮;
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作者单位

中南大学;

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授予单位中南大学;
学科药理学
授予学位博士
导师姓名周宏灏;
年度 2007
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类遗传药理学;心血管系统药物;
关键词
牛磺胆盐; 基因多态性; 中药提取物; 遗传药理; ASBT转运体; 抑制剂; 降胆固醇效应; 顶端钠依赖性胆盐转运体;

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