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原创性声明及关于学位论文使用授权说明
第一章绪论
1.1 A.ferrooxidans菌亚铁氧化系统介绍
1.1.1铜蓝蛋白(Rusticyanin)
1.1.2亚铁氧化酶(Iron oxidase)
1.1.3细胞色素Cyc2,Cyc1和细胞色素氧化酶
1.2铁硫簇组装机理
1.2.1铁硫簇组装蛋白IscA(Iron Sulfur Cluster Assembly protein A)
1.2.2铁硫簇组装蛋白IscU，IscS，IscR
1.2.3铁硫簇组装机理
1.3课题的研究目的与研究内容
1.3.1依据和目的
1.3.2论文的主要研究内容
1.3.3论文课题受资助情况
第二章实验材料和方法
2.1实验材料
2.1.1菌种
2.1.2培养基
2.1.3A.ferrooxidans菌基因组抽提试剂
2.1.4质粒提取试剂
2.1.5不连续体系SDS-PAGE电泳
2.1.6 SDS-PAGE胶保存试剂及装置
2.1.7蛋白亲和纯化试剂
2.2实验方法
2.2.1 PCR扩增
2.2.2酶切PCR产物及载体pLM 1
2.2.3载体和目的片段连接反应
2.2.4转化
2.2.5阳性克隆的筛选
2.2.6蛋白质表达转化
2.2.7蛋白质的条件表达
2.2.8 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
2.2.9蛋白质的纯化
2.3定点突变
2.3.1引物的设计
2.3.2 PCR扩增
2.3.3阳性克隆的筛选
2.3.4突变蛋白质的表达及纯化
2.4测试分析方法
2.4.1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
2.4.2紫外分光光度计(UV Scanning)
2.4.3电子顺磁共振(EPR)
2.4.4基质辅助激光解吸串联分行时间质谱(MALDI-TOF)
第三章铜蓝蛋白的克隆、表达、纯化及C138、H85、H143定点突变
3.1铜蓝蛋白基因的克隆
3.1.1铜蓝蛋白基因的克隆
3.1.2阳性克隆的筛选
3.2铜蓝蛋白的表达
3.2.1铜蓝蛋白表达条件的确定
3.2.2铜蓝蛋白大规模的表达
3.2.3 SDS-PAGE分析铜蓝蛋白
3.2.4 UV/Vis分析铜蓝蛋白
3.2.5电子顺磁共振波谱(EPR)分析铜蓝蛋白
3.2.6分子模拟铜蓝蛋白
3.3铜蓝蛋白C138、H85、H143定点突变
3.3.1铜蓝蛋白定点突变
3.3.2突变蛋白质的表达、纯化
3.3.3突变蛋白质的SDS-PAGE检测
3.3.4 UV/Vis分析突变蛋白
3.4本章小结
第四章亚铁氧化酶的克隆、表达、纯化及Y10定点突变
4.1亚铁氧化酶(Iron Oxidase,IRO)的克隆
4.1.1 IRO基因的克隆
4.1.2连接反应及阳性克隆的筛选
4.2亚铁氧化酶的表达
4.2.1亚铁氧化酶蛋白表达条件的确定
4.2.2亚铁氧化酶大规模的表达
4.2.3 SDS-PAGE分析纯化的样品
4.2.4基质辅助激光解吸-飞行时间质谱(MALDI-TOF)
4.2.5紫外扫描(UV/vis)
4.2.6电子顺磁共振波谱(EPR)
4.2.7亚铁氧化酶分子结构模拟
4.3亚铁氧化酶Y10定点突变
4.3.1亚铁氧化酶Y10的定点突变
4.3.2突变蛋白质的表达、纯化
4.3.3突变蛋白质的SDS-PAGE检测
4.3.4 UV/Vis分析突变蛋白
4.4本章小结
第五章铁硫簇组装蛋白A(Iron Sulfur Cluster Assembly proteinA，IscA)的克隆、表达、纯化及定点突变
5.1 IscA蛋白的克隆
5.1.1 IscA基因的克隆
5.1.2连接反应及阳性克隆的筛选
5.2 IscA蛋白的表达
5.2.1 Isc蛋白表达条件的确定
5.2.2 IscA蛋白大规模的表达
5.3 IscA蛋白的分析
5.3.1 SDS-PAGE分析纯化的样品
5.3.2 UV/Vis分析IscA蛋白
5.3.3电子顺磁共振波谱(EPR)分析IscA蛋白
5.3.4基质辅助激光解吸-飞行时间质谱(MALDI-TOF)分析IscA
5.3.5分子模拟IscA蛋白结构
5.4 IscA蛋白的定点突变
5.4.1 IscA蛋白三个保守的半胱氨酸的定点突变
5.4.2突变蛋白质的表达、纯化
5.4.3突变蛋白质的SDS-PAGE检测
5.4.4 UV/Vis分析突变蛋白
5.5本章小结
第六章铁硫簇体外组装机理的初步研究
6.1 Apo-形式蛋白质的准备
6.1.1实验材料
6.1.2蛋白质去铁硫簇
6.2铁硫簇的组装
6.3 UV/Vis测定Apo-及Holo-形式蛋白性质
6.4 MALDI-MS分析铁硫簇的组装结果
6.5铁硫簇的组装流程模型
6.6本章小结
第七章结论
参考文献
致谢
研究成果
