声明
摘要
中英文缩略词
第一章 前言
1．1 胆固醇氧化酶
1．1．1 简介
1．1．2 产胆固酵氧化酶的菌种来源
1．1．3 胆固醇氧化酶的催化中心和反应机理
1．1．4 胆固醇氧化酶的实际应用
1．2 酶的催化混乱性学说以及多功能酶
1．2．1 简介
1．2．2 催化混乱性的分类
1．2．3 催化混乱性的生物学意义
1．2．4 催化混乱性的鉴定方法
1．3 本课题的选择和研究意义
第二章 材料和仪器
2．1 实验材料
2．1．1 培养基
2．1．2 菌株和质粒
2．1．3 工具酶、试剂盒和主要化学试剂
2．1．4 仪器
2．1．5 缓冲液的配置
第三章 方法
3．1 产胆固醇氧化酶的菌种筛选
3．1．1 产胆固醇氧化酶的菌种初筛和菌种保存
3．1．2 产胆固醇氧化酶的菌种复筛和菌种保存
3．2 胆固醇氧化酶的分离，纯化、编码基因重组、表达和再纯化
3．2．1 胆固醇氧化酶的分离纯化
3．2．2 氨基末端(N)和羧基末端(C)氨基酸序列测定和比对
3．2．3 胆固醇氧化酶基因的克隆和在E．coli中的表达和纯化
3．3 胆固醇氧化酶的理化性质测定
3．3．1 胆固醇氧化酶的最适pH测定
3．3．2 胆固醇氧化酶的最适温度测定
3．3．3 胆固醇氧化酶的有机溶剂耐受性测定
3．3．4 胆固醇氧化酶的底物谱测定
3．4．1 基本原理
3．4．2 全质粒的PCR扩增以及饱和突变
3．4．3 饱和突变菌株的活力检测
3．4．4 突变菌株的胆固醇氧化酶的表达、纯化和活性测定
第四章 结果
4．1 产胆固醇氧化酶的菌株筛选
4．1．1 产胆固醇氧化酶的菌株初筛及复筛
4．1．2 菌种的保管和鉴定
4．2 胆固醇氧化酶的分离纯化
4．2．1 胆固醇氧化酶的分离和纯化
4．2．2 胆固醇氧化酶的蛋白质序列和基因序列的确定
4．2．3 胆固醇氧化酶的基因的克隆、重组及其表达产物的纯化
4．3 胆固醇氧化酶的理化性质测定
4．3．2 胆固醇氧化酶的最适温度测定
4．3．3 胆固醇氧化酶的有机溶剂耐受性测定
4．3．4 胆固醇氧化酶的底物谱测定
4．4 pBAD／M-ChOx质粒的饱和突变
4．4．1 胆固醇氧化酶的饱和突变筛选及其表达产物的纯化
4．4．2 突变体纯酶的活力检测
第五章 讨论
第六章 结论和展望
附录
参考文献
致谢
